[发明专利]通过胚胎发生法使向日葵再生的方法

说明书

本发明是关于一项以细胞或组织开始通过体细胞胚胎发生法使向日葵植株再生的方法。

尽管我们已能从分离的细胞或组织出发使许多栽培品种的植株获得再生，但以向日葵（Helianthus    annuus）进行的种种努力总是徒劳无益的。有关通过体细胞胚胎发生法使向日葵再生的数种方法在文献资料中曾有描述，但这些方法仅涉及稀有基因型，或杂交种。取下之活的植物组织是放在第一培养基中培植，这种培养基诱导愈伤组织的形成。接着，愈伤组织被转移到第二培养基中，这种培养基诱导体细胞胚胎和胚芽的形成。然后，胚芽被转移到第三培养基中，这种培养基诱导根部的形成，而在此阶段，可将再生的植株栽植入土中。

佩特森（Paterson）和埃弗雷特（Everett）[植物科学（Plant Sci.，）1985，42，125]配制了一种培养基，经乔治伊娃（Georgieva）、托多洛娃（Todorva）等人确定配制了最佳培养基[第九届国际向日葵学术讨论会论文集（Procqth Int.Sunflower Conference，托雷莫利诺斯，西班牙，1980，122）]，此培养基从胚轴的片段出发借助于体细胞胚胎法而诱导向日葵的一种栽培品种（SS 415B）的再生。取下之活的植物组织置于黑暗中培养2周，接着在光照下培养2-4周，所使用的是一种改性的穆拉布格和斯库格（MS）培养基，补充以40毫克/升的硫酸腺嘌呤、1毫克/升的6-苄氨基嘌呤（BAP）、1毫克/升的萘乙酸（ANA）和0.1毫克/升的赤雷素（GA₃）。在头两周 期间，有一种易粉碎的愈伤组织的形成，在光照下观察到绿色的斑点出现，它会转变成芽。通过一项解剖研究揭示了这些绿色斑点是类似于接合子胚胎的体细胞胚胎。

钱德勒（Chanuder）和简[农业文摘（Agronomy    Abstr.，1983，58）]叙述了从来自种间杂交的未成熟胚胎出发的向日葵的再生。未成熟的胚胎（4～5天）是置于由钱德勒（Chandler）和比尔德（Beayd）所描述的为抢救胚胎的生长培养基中[作物科学（Crop    Sci1983，23    1004）]。经2～3周之后，变大的胚胎被转移到以MS培养基为基质的带有植物生长激素和细胞激素可变剂量的各种不同配方中。在这些培养基中植物的生产遵照不同的途径，包括直接发芽或诱导愈伤组织后续器管发生或胚胎发生。最好的结果是用液体在0～1ppm之间的吲哚乙酸（AIA）和激素而获得的。此系统的优点是从一个孤单胚胎出发进行无性繁殖系的多种生产。

库利（Cooley）和威尔科克斯（Wilcox）（欧洲专利申请0172377）提出一项应用于栽培向日葵植物品种HA89和RHA27的方法，其中包括上述的三个阶段，并在三种不同的培养基中进行，头两个阶段的培养基必须含有一种植物生长素型的激素。然而，这项方法具有几种缺点，一方面是仅可应用于一个尺寸范围狭小（从0.1到2毫米）的胚胎，因而灵活性较差，另一方面需要在第一阶段和第二阶段之间调换培养基，总之所得胚胎的再生率还是很不够的。

本发明涉及一项向日葵栽培品种的再生方法，比较简单，且可导致胚芽具有改善移栽入土的再生能力。

更为特别地，本发明涉及一项从未成熟的胚胎出发进行向日葵栽培品种的再生方法，该未成熟的胚胎组织的育龄为4-21天，其尺寸在0.1-5mm之间，具有大尺寸的未成熟胚胎可按照通过微胚芽根轴的平面被切割成数个等分，该再生方法包括以下几个阶段：

-从细胞或组织出发通过在一种含有激素的诱导培养基中的培养而使胚胎发生的愈伤组织和细胞胚胎形成，及使所述胚胎生长的第一阶段，该诱导培养基含蔗糖浓度为8-12%，6-苄氨基嘌呤浓度为0.5-1毫克/升（2.2-4.4微摩尔）;

-使所述胚胎萌发及发育成可具有根部的植株的胚胎发生的愈伤组织培养的第二阶段，在该阶段中，所述胚芽生长培养基中的蔗糖浓度为2-4%，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1-0.5毫克/升（0.44-2.2微摩尔），以便其在一种含有激素的培养基中生长、发育和发芽;

-可能还有一个第三阶段，包括使植株生长和发育的培养;

其特征在于;头两个阶段是在同样性质的一种培养基中进行，且这种培养基含有一有效量的一种细胞激动素型的激素，而不含有植物生长激素。

下述说明中，百分比以重量，体积表示之，明确规定的例外。