[发明专利]２－氨基－４－甲膦酰丁酸抗性基因的制备方法及应用

说明书

先前未公开的德国专利申请P 36 28 747·4(“主要申请”)提出2-氨基-4-甲膦酰丁酸-抗性基因可从绿色产色链霉菌DSM 40736(普通保藏)或DSM 4112(依据布达佩斯条约的储存)的全部DNA中获得，已用下列方法选择了该基因的2-氨基-4-甲膦酰丁酰-丙氨酰-丙氨酸(PTT)抗性。即用BamHI切割，4000碱基对片段的克隆，PTT-抗性的选择，以及用该基因生产2-氨基-4甲膦酰丁酸抗性植物。它在细菌中可作为2-氨基-4-甲膦酰丁酰-丙氨酰-丙氨酸抗性标志，在植物细胞中作为2-氨基-4-甲膦酰丁酸抗性标志。有4000个碱基对并有抗性基因位于其上的Bam HI片段，在限制性图谱(图1)上已详细标明。

通过4000碱基对(4Kb)片段部分区域的克隆化，对编码区位置进行了更精确的定位，从中看出，抗性基因位于1.6KbSs-tII片段(主要申请图1，0.55至2.15位置)。再用Bgl II消化后得到0.8Kb片段。该片段在掺入质粒并转化变铅青链霉菌后，产生2-氨基-4-甲膦酰丁酰-丙氨酰-丙氨酸抗性。此种抗性依赖于2-氨基-4-甲膦酰丁酸氨基末端的乙酰化。因此，抗性基因是为乙酰转移酶编码的。

上述提到的0.8Kb片段的DNA序列在德文申请(附加专利号3642829.9)中又提及了。

从此序列可以确定起始密码子和基因序列的开放阅读序列。末端核苷酸是终止密码子TGA的一部分。

来自链霉菌的基因含较高比例的鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)。腺嘌呤(A)+胸腺嘧啶(T)。鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)的比值为30∶70。植物基因中所含鸟嘌呤和胞嘧啶的比例很低，约为50％。因此，作为发明思想的进一步发展，抗性基因的DNA序列通过再合成被尽可能完善，使其含有植物RNA多聚酶II能识别的密码子。

本发明与抗性基因的修饰有关，这一内容在德国专利申请P 36 28 747.4和附加申请P 36 42 829.9中提出了，即为密码子用于植物的基因适应。有关的氨基酸序列在附录中已被描述。本发明进一步实施方案将在权利要求中说明或在下文中解释。

已知遗传密码是简并的。即只有2种氨基酸由单一三联体密码编码，而剩余18种遗传学上可编码氨基酸被分配到2至6种三联体密码。因此，在基因合成时，理论上应有多种密码子组合可供选择。既然前述各个核苷酸在整个DNA序列中的相对比例(对其功能)可产生影响，故该比例可作为改善序列使之完美的标准之一。

对序列化的基因进行以下修饰：

1.链霉菌基因起始密码子GTG(附加申请中序列位置为258-260)被起始密码子ATG所替换。后者可被植物RNA多聚酶II利用。

2.在基因中，链霉菌基因密码子改变为适合于植物基因(鸟嘌呤/胞嘧啶比例)的密码子。

3.将终止密码子TGA置于序列的末端，以便终止翻译过程。

4.基因序列的起始端和末端上接限制性位点的突出末端，以便能够对基因放大并将其连接于植物调节序列之间。

5.将回文顺序减至最少。

本发明的DNA序列I(具有相应的氨基酸序列)在附录中描述。

由于限制酶Xba I(152位点)，Bam HI(312)，和Xma I(436)的三个特异内切点的存在，使部分序列的亚克隆成为可能。该亚克隆可掺入易于观察的克隆载体如pUC18或pUC19中。此外，许多针对限制酶的其它特殊识别序列被掺入基因。这样，一方面，可接近乙酰转移酶部分序列；另一方面，允许修饰作用完成。

      限制酶                在核苷酸序号后切断

                                 (编码链)

      BspM II                        11

      Sac II                         64

      Eco RV                         74

      Hpa I                          80

      Aat II                         99

    Bst XI                       139

    Apa I                        232

    Sca I                        272

    Avr II                       308