[其他]应用由重组体DNA技术制备的125—I—dsDNA测定在生物液体中的抗-DNA抗体效价的方法和用于此测定的分析仪器

说明书

系统性红斑狼疮（SLE）病人的血清中含有可与细胞核的多种组份（包括核酸核蛋白以及双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）的多种结合）反应的自身抗体。有些可与个别的碱基或核苷酸，与鸟嘌呤和缺少胸腺嘧啶脱氧核苷的序列反应，甚至与合成的聚核苷酸（1，2）反应。而且，这些自身抗体还可与脂类抗原复合物〔如心脂和其他的血小板膜磷脂，抗-聚（ADP-核糖）、组蛋白〕反应以及和蛋白多糖，即透明质酸和硫酸软骨素反应。但是，抗体与dsDNA或天然的DNA（nDNA）的反应是这种疾病的血清学上的主要标志，而且已经证明在诊断和监测疾病活动性时其测定dsDNA的能力是特别有帮助的。

已经设计出许多分析方法以检查和半定量在SLE病人体内的dsDNA。用于鉴定这些自身抗体的方法已包括凝胶扩散法（3）、补体结合法（4）、被动皮肤过敏反应法（5）、皂土凝集作用法（6）、血红细胞凝集作用法（7）、放射电泳法（8）、应用³H或¹²⁵I的放射分析法（9）和酶免疫分析法（10）。

大多数（如果不是全部的话）上述的方法缺乏特异性和灵敏性。在大多数情况下，由于缺乏SEL与其他结缔组织疾病的鉴别诊断的特异性，而得到假阳性结果的报告。

虽然在应用放射分析和酶免疫分析来测定SLE在有关病情程度和严重性方面已表明是合格的。但是，所有这些方法都是应用得自小牛胸腺的nDNA的标记制剂，而这种DNA是由不同长度的高分子量的DNA片段〔平均约含有2万碱基对（20kbp）〕聚合而成的，因此这些制剂也含有不同数量的ssDNA。

虽然在这些制剂中ssDNA污染物与补体Clq结合，但这些20kbp的DNA分子常常非特异地结合到循环的血浆蛋白质上。因此，这些通常用于测定dsDNA（nDNA）抗体的免疫学方法，常常要求在DNA示踪化合物与循环的抗-DNA抗体进行免疫学的反应之前，先将血清或血浆样品在56℃预处理30分钟以钝化补体Clq。

在理想的情况下最好是一个循环的抗-DNA    IgG分子仅与一个或两个给定长度而没有污染物（特别是ssDNA）的标记dsDNA分子相结合。

为此目的，已设计了在体内将¹²⁵I-脱氧胞苷引入海拉细胞株内而制备标记的dsDNA（特别是用¹²⁵I-标记的）的技术。但是，由于在这类制剂中通常有ssDNA污染物作为副产品存在，所以这些在体内标记的方法不能产生高纯度的标记dsDNA。

本发明的目的为在免疫学方法中特别是用¹²⁵I-标记的dsDNA的放射分析中防止上述的缺陷发生。但是其他的标记dsDNA分析也属于本发明的范围。

本发明的目的在于设计一种具有一定长度的适当的限定碱基对的dsDNA分子，而这种制剂是不含有ssDNA的。当应用一个产生探测剂（125-碘（¹²⁵I）的信号、酶标记物、萤光标记物、化学发光或生物发光标记物）标记时，这种制剂会有一个适当限定的特异活性，而且是稳定的，并且会特异地结合到在SLE血清或血浆中的循环抗-DNA抗体上。

为了达到这一目的，必须构建一个质粒DNA并且是从不含ssDNA的大肠杆菌制备的。用适当的限制性内切酶将质粒切割而产生长度不超过1.5kbp的dsDNA，并用作示踪物物质。在本发明中现在所用的质粒是由大肠杆菌制备的，但是也可以应用生物体例如用枯草杆菌、putida假单胞菌和酿酒酵母所含有的任何其他适合的质粒。其他含于生物体的质粒对本领域中有经验的人来说都是明了的。此外，化学合成的dsDNA也可以用来完成本发明的目的。

现在应用下面的实例对本发明作详细的说明：

实例1

质粒DNA、pNDPC1的制备。

图1 表示用于本发明实例中的质粒DNA、pNDPC1的限制性内切酶图。质粒pNDPC1的构建如下：用Cfr Ⅰ部份地消化pUC 18（Yanisch-Perron，C.等人，Gene 33：103（1985）），然后用在图1中所示的T4-DNA连接酶使其自身连接。选择性的标记物的AP^r和Lac^-。

用标准的实验方法将带有2431碱基对的pNDPC    1    插入大肠杆菌K12    Jm109中并在一种LB培养基（1%胰蛋白，0.5%酵母萃取液，0.5%NaCl）中培养杆菌。然后用通常的方法纯化质粒。