[发明专利]碱性成纤维细胞生长因子的突变蛋白，DNA及其应用

说明书

本发明涉及碱性成纤维细胞生长因子(以下简称为bFGF)的突变蛋白，具有编码bFGF突变蛋白之碱基顺序的重组DNA及其应用。

bFGF是一种主要由脑垂体分泌的碱性多肽激素，分子量大约为17,000，它首先是作为对成纤维细胞(例如BALB/c3T3)具有很强的生长促进作用的因子而分离出来的(D.Gospodarowicz；Nature 249；123，1974)。但此后又证明，它几乎对所有产生于中胚层的细胞都具有生长促进作用(D.Gospodarowicz et al，National Cancer Institute Mon-ograph 48：109，1978)。具体地说，bFGF的血管生成作用及其细胞生长促进作用加在一起，表明它能够作为治疗药物用于治疗外伤，以及作为预防和治疗药物用于血栓形成、动脉硬化等的预防和治疗。

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6507(1985)中已首先对牛bFGF作了描述。在Science233：545(1986)中公开了牛bFGF的氨基酸组成，该氨基酸顺序是由通过克隆人bFGF的cDNA所产生的克隆推测的。

Biochem.Biophys.Res.Communi.135：541(1986)报道了从人脑中提取人bFGF。

在Euro.Mol.Biol.Org.(EMBO)J.5：2523(1986)和PCT国际专利公开WO/01728中阐明，人bFGF的组成氨基酸，是用牛的bFGF作为探针，通过克隆人bFGF的cDNA所产生的克隆为基础进行推测并鉴定的。

此外，在FEBS Letters 213：189(1987)中，描述了通过培养经克隆人bFGF的cDNA所产生的转化子来生产人bFGF的方法。

将人bFGF与牛bFGF相比较，发现人bFGF在112位是Thr，而牛的是Ser；人bFGF在128位是Ser，而牛的是Pro(在此例中将N末端的Pro定为第一个氨基酸)。

本发明人设想通过修饰氨基酸顺序，能够改善bFGF在细胞中的稳定性、生产力及每个分子的细胞增殖活性，此外，还能加强未知的生物学活性。

再者，由DNA重组技术用微生物生产的生物活性蛋白含有半胱氨酸残基，它们对于活性并不重要，但其可能形成不需要的分子间或分子内桥键。

在由DNA重组技术生产bFGF的过程中，发现在含有高浓度bFGF的大肠杆菌提取物中有不同构象的分子。这些构象可能是由于分子内或分子间随机形成的二硫键而产生的，并因此使得回收时纯化和还原bFGF变得很困难。

鉴于这一事实，本发明人希望对微生物产生的生物活性蛋白(例如重组的bFGF)进行这样的修饰，即在对其活性不产生不利影响的情况下，降低或消除它们形成这种分子间桥键及分子内连接的能力，且不至于形成不期望的三级结构(如降低蛋白活性的构象)。

本发明人通过DNA重组和定位诱变方法构建了业经修饰的bFGF突变蛋白，进行了改善其稳定性、提高其胞内生产力和活性的研究，并描述了其生物活性的变化；其结果是，本发明人发现了符合这些目的的突变蛋白。本发明人在此基础上进行了进一步研究并完成了本发明。

本发明涉及：

(1)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的一种突变蛋白，

(2)具有编码上述突变蛋白(1)之碱基顺序的重组DNA，

(3)一种携带含重组DNA之载体的转化体，该DNA具有编码

   上述突变蛋白(1)的碱基顺序，以及

(4)生产上述突变蛋白(1)的方法，其包括在培养基中培养携带含

   重组DNA之载体的转化体，该DNA具有编码所述突变蛋

   白的碱基顺序，以在培养基中生产和积聚该突变蛋白。

就bFGF来说，只要它是来自温血哺乳动物，任何bFGF都可包括在其中。

但作为其典型实例，可以提及的有人、牛和鼠的bFGF。

尤其是包括下式代表的氨基酸顺序的多肽：Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro                                     [I]