[其他]编码脱乙酸基头孢菌素C合成酶和脱乙酰头孢菌素C合成酶的重组DNA表达载体及DNA化合物

说明书

本发明涉及编码脱乙酸基头孢菌素C合成酶和脱乙酰头孢菌素C合成酶活性的DNA顺序。脱乙酸基头孢菌素C合成酶（DAOCS）催化由青霉素N形成脱乙酸基头孢菌素C（DAOC）的反应，它通常被称为扩展酶（expandase）。脱乙酰头孢菌素C合成酶（DACS）催化由DAOC形成脱乙酰头孢菌素C（DAC），这是一个羟基化反应。这些反应是重要抗生素生物合成中的关键步骤，这些抗生素如来自顶头孢霉（Cephalosporium    acremonium）的头孢菌素和来自Streptomyces    clavuligerus的7α-甲氧基头孢菌素。

本发明方法中所用的DNA化合物在单一的开放读码中编码DAOCS和DACS。转录此开放读码，然后翻译所产生的mRNA，可产生具有DAOCS和DACS两种活性的单个多肽链。由于本发明化合物的这种双重性，术语“DAOCS/DACS”、“DACS/DAOCS”、“扩展酶/羟化酶”和“EXP/HYD”用来标明具有DACS和DAOCS两种属性的特定基因、编码顺序或酶。这些活性的连锁并未普遍观察到;例如，产生头霉素的链霉菌用两种不同的多肽表达DAOCS和DACS活性。虽然，同时表达DAOCS和DACS活性是方便的，并通常是最佳的，但它并不是本发明关键性的部分。正如本文所举例说明的，基因工程技术提供了现成的分离编码DAOCS和DACS的遗传信息而分别表达DAOCS或DACS活性的方法。因此，本发明方法中所用的说明性化合物、载体和酶活性的双重性并非一种限制，因为本发明还包括单一特性的分子，即那些只表现DACS或DAOCS特性的分子，以及利用这些单一特性化合物的方法。

编码DACS/DAOCS活性的DNA化合物从顶头孢霉基因组DNA中分离得到，并用来构建重组DNA表达载体。其中有三种类型的表达载体特别适用于本发明的方法：第一种在大肠杆菌（E.Coli）中，第二种在顶头孢霉中，第三种在产黄青霉（Penicillium    chrysogenum中驱动DAOCS/DACS活性的高水平表达。

大肠杆菌产生的DAOCS/DACS活性催化由青霉素N形成DAOC，以及由DAOC形成DAC。本发明的这些大肠杆菌转化体的细胞粗提物表现出DAOCS/DACS活性，并且无需任何预先活化处理。这种大肠杆菌表达方法及相关的载体和转化体，为大量获取活性DAOCS/DACS酶提供了有效手段。DAOCS/DACS酶不仅可用于生产DAOC和DAC，还能用于扩展青霉素N以外的青霉素，以及使DAOC以外的头孢菌素羟基化以形成新的抗生素。

本发明的头孢霉表达方法及相关的载体，可用来构建用于制药工业的菌株。头孢霉是一种有重要经济意义的生物，用来生产青霉素和头孢菌素等抗生素。用本发明的表达载体转化头孢霉，可在转化体中产生较高水平的胞内DAOCS和DACS。这些转化体可用于工业发酵中，以提高其抗生素生产的效率和产率。

本发明的青霉素表达方法及相关载体，最适用于在高水平生产青霉素的青霉菌株中导入头孢菌素合成活性。DAOCS活性在单独或与其他活性（如DACS或差向异构酶）结合的情况下，都能用于将各种青霉素转化成头孢菌素。例如在青霉中，异青霉素N差向异构酶活性（例如来自顶头孢霉）和DAOCS活性的同时表达导致DAOC的产生，这是一种在青霉中前所未知的代谢产物。

本发明还提供了一种将重组DNA分子导入青霉菌中的改进方法。这种新的转化系统采用构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的amdS基因。用乙酰胺（CH₃CONH₂）作为转化平皿上的唯一碳源或氮源，能够从未转化的细胞中选择出用含有amdS基因的载体转化的青霉宿主细胞，这是因为野生型的青霉宿主细胞不表达乙酰胺酶活性，因此它们不能在此平皿上生长。