[发明专利]为非甲非乙型肝炎特异性抗原编码的DNA片段，含该DNA片段的表达载体，其转化体及生产该抗原的方法

说明书

本发明涉及用重组DNA技术生产非甲非乙型肝炎特异性抗原。更确切地说是关于为一种抗原编码的DNA片段，该抗原是在感染了非甲非乙型肝炎的宿主上特异产生的;一个含该DNA片段的表达载体;具有该表达载体的转化宿主以及通过培养该宿主生产非甲非乙型肝炎特异抗原的方法。

在病毒性肝炎中，已发现了甲型乙型肝炎的病毒。因此，可以用免疫学方法诊断这种疾病。

还有另一种与甲型和乙型不同的肝炎，称作非甲非乙型肝炎，它占输血后肝炎的90%以上〔见NIPPON    RINSHO，（Japan    Clinic），35，2724（1977）〕及〔J.Biol，Med，49，243（1970）〕然而，至今尚未确定非甲非乙型肝炎病毒。仅仅知道人类非甲非乙型肝炎病毒也可感染黑猩猩。〔见LancetⅠ，459，（1978）;ibid，463（1978）〕。

很多科研人员主要用感染该病患者的血清寻找与非甲非乙型肝炎有关的抗原-抗体系统。然而，没发现确定的系统。所以只能用所谓排除诊断法诊断非甲非乙型肝炎。即首先鉴定病人的肝炎是否由已知引起肝病的病毒如：CMV，HSV，EBV等感染所致;如果不是，就诊断为非甲非乙型肝炎。这样地诊断非甲非乙型肝炎就需很多时间和劳动。

已从肝细胞感染了非甲非乙型肝炎的人与猩猩提纯出用于直接诊断该种肝炎的特异性抗原蛋白，并提出用对该抗原特异性的单克隆抗体治疗非甲非乙型肝炎（见日本专利公开N.176856/86和56196/86）。

当用该非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白作为诊断试剂时，就需要大量该蛋白。然而，还没有合适的方法从感染了非甲非乙型肝炎的猩猩肝细胞大量纯化这种抗原蛋白。

另一方面，为用核酸杂交方法检测给非甲非乙型肝炎特异抗原编码的基因，进而用重组DNA技术生产对非甲非乙型肝炎特异的抗原，就必须得到为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码的基因片段。

本发明人做了极大的努力通过遗传工程技术大量生产这种特异性抗原蛋白，分离到为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码的基因片段，该基因片段可用于生产这种抗原。另外，发明人还成功地重组了含该片段的表达载体。从而达到本发明的目的。

本发明的目的之一是提供一种DNA片段，该片段含为感染了非甲非乙型肝炎的宿主细胞中特异性产生的抗原编码的碱基顺序，或含为具有与上述特异抗原等同生理活动的非甲非乙型肝炎特异蛋白抗原编码的碱基顺序。

本发明另一个目的是提供含有该DNA片段的表达载体，该DNA片段插在载体启动子下游的克隆切点。

本发明再一个目的是提供用上述表达载体转化宿主细胞得到的转化体。

本发明还有一个目的是培养该转化体来生产非甲非乙型肝炎特异抗原的方法。

下面将根据附图详述本发明的目的及优点：其中

图1a-1e表示为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的碱基顺序;

图2表示杂交启动子Pac的碱基顺序;

图3a-3c表示下面所述例1中得到的cDNA片段，及用它推算出的氨基酸顺序;

图4a-4c表示含有非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白全长基因序列的cDNA碱基顺序，该cDNA是在下面所述例2中得到的，其中的57-1388碱基序列是为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码的。

图5图解说明组建质粒PCV44H;

图6图解说明组建质粒PCV44B;而

图7图解说明组建质粒PCZ44。

下面将详述本发明。

根据本发明，得到含有为非甲非乙型肝炎感染肝细胞而特异产生的抗原蛋白编码碱基顺序的DNA片段。

本发明的该DNA片段是用下面方法制备的。

首先，感染了非甲非乙型肝炎的人或黑猩猩的肝组织在硫氰酸胍水溶液中均浆，再根据chirgwin等人的方法〔见Biochemist-ry，18    5294-5299（1979）〕，进行氯化铯密度梯度离心，沉淀是分离出的总体RNA。分离后再用苯酚萃取和酒精沉淀纯化总体RNA。

本发明用作肝组织来源的“感染非甲非乙型肝炎的个体（人或黑猩猩），可能包括感染了最近才命名的所谓（D）型肝炎的个体。

已知抗原基因的mRNA一般都具有Poly-A链。因此，可用常规的方法，将总体RNA进行寡（dT）纤维素柱层析，分离出的含Poly（A）的RNA（PolyA+RNA）作为mRNA材料。