[发明专利]产生具有第八因子活性的第八因子缺失突变体的方法

说明书

本发明涉及到一些具有第8因子活性的新的蛋白质以及使用遗传工程细胞系感微生物来制备它们的方法。

第8因子是一种医学上重要的蛋白质，因为它是血液凝固机制中的一种方要成分。它在健康人血浆中的浓度大约为100ng/ml。第8因子缺乏导致称为血友病A的一种出血性疾病，它主要见于男性，因为第8因子基因位于X-染色体上。本病是一种重要的遗传性出血性疾病，男性人群发病率约0.01％。

血友病A可以通过输入自健康人获得的含第8因子的血浆来治疗。然而该疗法有几种缺点。首先，第8因子的来源有限且价格昂贵，因为它在供者血中的浓度很低。其次，现行的血浆分级分离方法产率较低，第8因子的实际含量不足。第三，每一例血友病A患者接受了采自许多供血者的血液制品，从而获得传染病的危险性升高，这些传染病包括例如由存在于供血中的非甲、非乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，艾滋病(AIDS)病毒引起的各种疾病。另一问题是所谓抑制因子的出现，它是接受外源性，同种基因性第8因子制品治疗的血友病患者所产生的抗第8因子抗体。

这些问题已促使人们去认真研究用重组DNA技术的方法来获得第8因子，以代替自供者血液中的分离方法。几组学者已报道了由人类mRNA所获的第8因子cDNA分子克隆和在哺乳类，酵母菌，或细菌细胞中生产具有第8因子活性的蛋白质(WO85/01961，EP0160457，EP150735，EP0253455)。

欧洲专利申请0253455介绍了一种使用转化微生物生产具有第8因子活性蛋白质的方法。该种蛋白适于制备具有第8因子活性的药学制品并可激发能识别具有第8因子活性蛋白的抗体。

另一组研究者的目标是发现具有第8因子活性并能纠正血友病A患者凝血缺陷的其它种蛋白质。欧洲专利申请EP150735，EP123945，和Brinkhous等(1985)指出，第8因子活性不仅取决于第8因子蛋白本身，而且还决定于它的某些蛋白水解产物。蛋白水解酶作为凝血链式反应的一环见于血液之中，并部分降解第8因子为分子量92KDa和80KDa的两个亚单位多肽。据认为，当这两个亚单位的复合体或其一部分在血中出现时，第8因子活性增强(Fay等，1986，Eaton等1986a)。与其它血浆蛋白不同，当以已知的重组DNA 方法制备时，第8因子是一种不尽理想的低产蛋白质。甚至该蛋白并不以完整肽链的形式出现，因此制品很难进一步分离和纯化，费用也高。

Eaton等(1986b)发现，从第8因子蛋白的中心区去除第797-1562之间的766个氨基酸之后，余下的蛋白仍保有第8因子活性。而且，用含有编码该缩短的蛋白质的DNA的载体转化的哺乳类细胞比带有编码全部长度蛋白的密码的易感细胞表现出更高的产率。

PCT专利申请WO86/06101透露，既使将第8因子蛋白删除到仅离中心区880个氨基酸仍显示第8因子活性。最多的缺失延伸达Thr-760到Asn-1639(按表IV计数)。已提及的从Thr-760到Lys-1674的更大的缺失显然对其并无影响。这些蛋白可以用含编码这些蛋白质的cDNA的一个载体转化得到的哺乳类细胞系体外培养来制备。对所有天然的或制备的第8因子蛋白来讲，缺失绝不能延伸到中心区边界以外，因为该分子的余下部分是维持凝血活性的基础。

第8因子是纠正象血友病A那样的凝血缺陷的蛋白质，其特性即第8因子活性。第8因子以与一种蛋白质，Von Willebrand因子(VWf)，结合状态循环于血液中，该蛋白防止第8因子过旱衰变。

第8因子由表IV所述的氨基酸序列所定性。序列的编号开始于Ala-1，它为含19个氨基酸的信号序列后的第一氨基酸，末端为Tyr-2332。该编号用于本专利说明书。

“具有第8因子活性的蛋白质”“第8因子蛋白质”或“类第8因子化合物”包括在天然第8因子之内的各种大小的蛋白质，它们均具有经确定的氨基酸序列的核心部分或与第8因子的一部分氨基酸序列是同质的，当输给血友病A患者时，它们具有第8因子活性以纠正凝血缺陷。该凝血缺陷的纠正可能受到已被破坏的凝血机能中直接干扰的影响或上述抑制因子患者体内的抗第8因子蛋白抗体中和作用的影响从而随后输入的凝血第8因子蛋白能显示其全部活性。

作为激活蛋白对全长第8因子蛋白作用的结果，形成了亚单位蛋白质，它们的分子量分别为92KDa和80KDa。92KDa-亚单位自全长第8因子蛋白的氨基末端始而向下延伸，80KDa-亚单位自羧基末端始而向上延伸。