[发明专利]在甲基营养细菌中表达外源DNA的启动子，制造它的方法及该启动子的应用

说明书

众所周知在甲基营养细菌中用不同的载体系统及转录信号都能完成外源DNA的表达。以此为目的的转录信号既是来源于抗性基因，又是对应经常用于在大肠杆菌基因充分表达的启动子，如：tac，lac，trp或噬菌体启动子。Windass等人，在“自然”287期，396页（1980）曾叙述过在甲基营养菌中克隆和表达大肠杆菌谷氨酸脱氢酶;Hemnam等人在“自然”279期，80页（1982）和De    Mayer等人在美国科学院学报79卷4256页（1982）都探讨过在甲基营养细菌中表达卵清蛋白和α1-干扰素，仅举了些例子。

欧洲专利申请98，967叙述了为克拉拉甲基单胞菌（Methylomonasclara）所用载体系统的进展。甲基营养细菌的天然质粒用作制备杂交质粒，该质粒在克拉拉甲基单胞菌及大肠杆菌中均能稳定复制。德国专利申请3，635，583建议用天然甲单胞菌质粒片段制备这种杂交质粒。

然而，对克拉拉甲基单胞菌天然质粒还不太清楚，即对它们的生物学功能还未确定。然而令人吃惊的是在这些质粒上都能确定其高转录活性区。

本发明有关：

1.用克拉拉甲基单胞菌天然质粒的启动子区域来表达大肠杆菌和甲基营养细菌的基因。

2.含有1所述启动子区域的杂交载体。

3.用2所定义的杂交载体在大肠杆菌和甲基营养细菌中制备多肽。

下面将详述本发明，特别是在所选实施例中详述。本发明也在权利要求中被定义。

可以用Southern和Northern吸印法测定克拉拉甲基单胞菌质粒的特定区域是否可转录。这将需要与该微生物天然质粒杂交的克拉拉甲基单胞菌完整的RNA。

欲得到本发明的启动子，最好从克拉拉甲基单胞菌DSM2397的质粒pBE3开始，该质粒在欧洲专利申请98，969中已叙述。用限制酶，最好是EcoRⅠ，AvaⅠ和HincⅡ切pBE3。将每个片段吸印并与放射标记的完整RNA杂交，结果看出EcoRⅠ片段3，AvaⅠ片段2和HincⅡ片段1具有高转录活性。其余的pBE3DNA片段虽然与DSM2397RNA探针杂交，但比上述片段弱的多。

用同样方法可测出这些片段与来自大肠杆菌完整RNA的强杂交，该大肠杆菌含有克隆在pBR322中的质粒pBE3。

利用容易检测特性编码的寻找一启动子质粒，特别为大肠杆菌组成的这种质粒，有可能在PEB3上或最好用BalⅠ和MboⅠ适当酶解后，在PBE3上述片断上检测到启动子区域。可选用pkk232-8作为寻找启动子质粒，它具有使氯霉素失活的氯霉素乙酰转移酶（CAT）的少启动子结构基因。也可在pBE3或它的片段连接在pkk232-8上后，转化感受态的大肠杆菌菌株，最好用大肠杆菌HB101，从而在含氯霉素的营养培养基鉴定所需的克隆。用各种限制酶水解抗氯霉素克隆的质粒DNA来鉴定其特性。如：克隆MboⅠ片段时可用MboⅠ，鉴定克隆BalⅠ片段可用EcoRⅠ和BamHⅠ。含有pBE3的杂交质粒，利用EcoRⅠ和BamHⅠ可鉴定出4个片段，而用MboⅠ可鉴定3个片段，每个片段都表达以前静止的不含启动子的CAT基因。

当用BalⅠ或MboⅠ水解EcoRⅠ片段3时，用CAT质粒pkk232-8，能鉴别出一个约430bp的片段，它与在完整pBE3    DNA的霰弹枪克隆上发现的一个片段相同。测定其顺序，发现它是用霰弹枪法克隆MboⅠ片段后得到的约340bp的片段。可用市售计算机程序定位这个启动子区。在这两种情况有启动子重叠区，就是说该右边的P_R启动子顺序与左边的R_L启动子顺序相重叠。该顺序在表1说明。

所谓这些启动子的交感序列本质上不同于已知大肠杆菌启动子的交感序列，如：

a）对其-35区为：TTGGTT或TTGCGT或TTGGCT或TTGTTC

b）对其-10区为：TATGTT或TAAAAT或TATGAT

在-35区和-10区之间有任意所需数目的碱基对（bp），最好是15到19个，主要由G和T组成。在-10区和转录起始区碱基数目也是任意的，最好为7个碱基对左右。每种情况都出现Shine-Delgarno序列。

无论在大肠杆菌还是在甲基营养细菌，最好是在克拉拉甲基单胞菌（特别是DSM2397）中，这些启动子序列都导致下游基因的转录，并可克隆到大肠杆菌/克拉拉甲基单胞菌穿梭载体中，从而使外源基因表达。表1所示BalⅠ或MboⅠ片段启动子序列是用于表达外源基因最佳的启动子。