[发明专利]制备单链尿激酶的方法

说明书

本发明涉及制备单链尿激酶原（以下称为前-uPA（pro-uPA）或sc-uPA）的方法，特别是指这样一种生产前-uPA的方法，它包括从人体基因库中获得尿激酶（uPA）基因，把它插入到一个表达载体中，并将所得质粒载体DNA引入至动物细胞内，以获得一个能生产编码蛋白的转化子，从而从上述动物细胞中获得糖基化的前-uPA。

这项发明进一步要获得的产物是人类uPA启动子衍生物，它能控制象uPA一类基因的转录。该项发明还包括一些新的真核细胞表达载体以及与此有关的表达细胞的转化。在表达载体中，将一个cDNA或一个基因放于人类uPA启动子或其衍生物的转录控制之下。

这项发明的另一个方面是一个“表达盒”，它含有人类uPA启动子或其衍生物、人类uPA转录起始子（即所谓的TATA盒）和一个多聚接头。

尿激酶（uPA）是人尿中一种纤维蛋白溶酶原激活剂，可用来治疗各种形式的血栓形成或栓塞疾病。

尿激酶的制备以纯化从人类尿中提取的酶为基础。随着细胞培养技术的发展和特异性抗尿激酶抗体（单克隆及多克隆抗体）的应用，现已知道，uPA是一个细胞内产物前-uPA的激活产物（Wun等，1982，J.Biol.Chem.257，7262-7268;Nielsen等，1982，Biochemistry    21，6410-6415）。前-uPA是一个单链蛋白质（sc-uPA），而uPA是一个双链蛋白质（tc-uPA），sc-uPA中一个单个肽键的裂解，使scd-uPA一转变为tc-uPA

这种单链前-uPA在蛋白水解酶，如胰蛋白酶或血纤维蛋白溶解酶的作用下，发生特异性裂解，使其专一性活力增加50倍以上。在体内，这种转化主要是由血纤维蛋白溶解酶起作用的。

1977年Nolan在人类胚肾细胞培养物中已找到纤维蛋白溶解酶原激活剂的非活性形式（Biochem    Biophys    Acta    1977;496，384-400）。这种作者认为是尿激酶的原激活剂形式的物质，可以被胰蛋白酶激活，而无分子量的变化。一旦被激活，就能被兔抗人尿激酶抗体抑制。用苄脒-琼脂糖亲和层析法可将“原激活剂”的非活性形式和活性形式分开。

单链纤维蛋白溶解酶原激活剂的分子量为56，000，在血纤维蛋白板上，其专一性活性为40，000-50，000CTA单位/mg，对血纤维蛋白的高亲和力可见于欧洲专利40238上。

欧洲专利申请出版第92182号就是关于用重组DNA技术制备尿激酶衍生物，它特别阐明了在一个原核生物的宿主（大肠杆菌）中通过重组DNA技术得到的低分子量尿激酶（约30，000D）的纯化和定性。

另一欧洲专利申请EP-A-37687描述了编码具有人类尿激酶特性的纤维蛋白溶酶原激活物的脱氧核糖核酸（DNA）片段，以及在某种细菌中表达该DNA顺序的方法。而在欧洲专利申请出版第154272号，描述了在动物细胞中生产糖基化单链尿激酶的方法，它是从已建立的人类肾脏细胞素的mRNA得到DNA，通过重组DNA技术而生产糖基化单链尿激酶。Riccio等，在Nucleic    Acid    Research，13，2759（1985）描述了人类uPA启动子区域约800碱基对片段的顺序，它含有一个5′侧翼区域。

如下所预期的，这项发明阐明了一个在动物细胞内通过重组DNA技术生产前-uPA的方法。这一方法包括把一个DNA载体引入适当的动物细胞中生产，该载体上有一人类基因组起始点DNA片段，含有人类-uPA基因的编码区域而不是调节区域。经培养，可生产出与自然发生的前-uPA有相同氨基酸顺序的人类型前-uPA。

含uPA编码区的人类基因组起始点DNA片段，是在一个适当的载体内，用一段基因本身或在已知编码顺序的基础上合成一个适当长度的DNA片段作为DNA探针或用一个cDNA衍生的探针进行基因库的筛选，而从人类基因库获得的，如按照这一技术，在λ噬菌体或Cosmids装配型质粒内的基因库中获得。

这个uPA编码片段是通过SmaⅠ消化DNA克隆而得到的一个7.3千碱基对片段，这样一个DNA片段在下文中还会提到，称为开放性读码（ORF），表示一个含有uPA·mRNA的转录一转译单位的基因组DNA顺序，它可能被插入一些内含子，更可能包含5′和3′不转译区域或与或其中一部份具有转译效率或mnRNA稳定性有关的一个部分。较好ORF的一例就是一个上述所定义的顺序，其中插入有10个内含子。