[发明专利]将基因转入植物的方法

说明书

本发明涉及到一种基因转入植物的方法，即利用分离后，未成熟的在试管内培养的花粉粒，以及从中产生的种子和繁殖产物。

将基因转入植物内可采用不同的技术。每种技术都有它的优点和缺点(Goodman et al.Scicnce 236：48-53，1987)。根瘤土壤杆菌是现在最常用的载体。但是，它限制了宿主的范围。将根瘤土壤杆菌用作载体，仍然依赖于体外培养的体细胞的再生，以产生能形成基因转移子代的基因转移植物。用电穿透，脂质体，显微注射和其它物理—化学方法等进行的直接基因转移，在很大程度上取决于采用原生质体作为靶细胞。然而，在很多品种中，从原生质体再生是困难的，甚至在某些品种中是不可能的。

作为这些基因转移方法的改进，曾有人提出采用一种不同的靶细胞，即花粉粒。根据D.Hess，Plenum Press，New York，519-537(1975)，成熟花粉有可能载上外源DNA，并通过天然传粉和受精作用将此外源DNA转移至卵细胞，作为“超载体”，类似地，X-射线处理过的花粉据说能够将照射过的基因组片段转移至卵细胞(Pandey，Nature256：310-313，1975)。Dewet(WO85/01856)报导，经外源DNA处理过的玉米花粉在发芽时可载此DNA，并在受精后将其转移至卵细胞。

尽管基因转移至花粉以及通过花粉进行转移具有极大的潜在重要性，但其它实验室至今还未能重复出Hess，Pandey和Dewet的结果。例如，Engvild(Theor，Appl，Genet 69：457-461，1985)就没能重复出Pandey的实验。在Hess(1975)和Dewet的实验中，携带外源DNA至花粉粒，以及转移的DNA的遗传学和分子学证据是整个推理过程中的关键环节。表现型证据和生理学证据是不够的(Hess in：Genet icManipulation in plant breeding，de Gruyter，Berlin，NewYork 803-811，1986)。Sanford等人的实验(Bioiechnology andecology of pollen(Mulcahy D.ed)，Springer，Heidelberg，New York，71-75，1968)也表明，将成熟的兰根朵夫烟草花粉与土壤杆菌共同培养并不产生基因向花粉中的转移。在大量实验中，Negrutiu，Heberle-Bors和Potry kus(Loc.cit.65-70，1986)未能成功地转移能产生抗卡那霉素药性的新霉素磷酸转移酶基因至成熟的花粉(shillito et al.Biotechnology 3：1099-1103，1985)。因此，根据近期文献所述方法，无法证实Hess和Dewet的说法。Hess和Dewet的结果不能重复这一事实可这样解释，成熟的花粉粒一旦被置于对于基因转移所必须的水介质中时，便立即开始形成花粉管，显然，它们在此阶段不再能育，或者说用于基因转移的时间太短了。

在Planta 170：141-143(1987)中，Pareddy等人报导了未成熟玉米雄穗在体外的培养和成熟。用分离的成熟花粉传粉，便可从传过粉的植物得到种子。通过基因标志物方法，不能证实是否有成功的受精作用。

意外的是，已发现可以在没有天然营养组织情况下培养未成熟花粉粒，此外可将外源基因在成熟的不同阶段引入到这些分离的，未成熟的花粉粒中，结果，利用这些成熟的花粉粒，植物可被传粉，受精，从而使正常的种子形成，发芽，并繁殖。

因此，本发明涉及一种基因转入植物的方法，其包含：

a)在营养溶液中从花药分离未成熟花粉粒，并移除它们所附着的组织；

b)在一利营养溶液中培养这些分离的，未成熟的花粉粒，

c)在体外培养和成熟过程中转移外源遗传物质至花粉粒，

d)在体外使转化的花粉粒完全成熟，

e)用转化的花粉粒向受体植物传粉，并从受体植物得到种子。

一种全新的基因转移至植物的策略是，将基因转入分离的、未成熟的花粉粒，体外成熟，以及采用花粉作为普遍的“超载体”。与其它方法比较，此法大大简化，因为细胞培养期大大缩短，而伴有比较麻烦的体克隆变异现象的再生阶段也被省去了。采用此新方法，还可以转化那些迄今未能成功进行基因转移的植物：例如，多种谷物，豆类和树木不能从单细胞或原生质体再生。