[发明专利]高活性纤维素酶的制造方法

说明书

本发明属于微生物的生产工艺。

目前，纤维素酶的生产多采用对纤维素酶有诱导作用的天然纤维素类物质作为碳源的固体发酵方式进行。这些天然纤维素类物质，诸如玉米秸粉、麦秸粉、稻草粉、高梁秸粉等等，在发酵之后，作为大量的残渣遗留下来。由于这些残渣是已被微生物分解、利用过的，故成为难以再分解和利用的废物，若不处理将造成严重的环境污染。日本曾特许（昭58-42759）铃木修藏等人的发明：利用纤维素酶水解天然纤维素的残渣作为培养基的碳源使用，来制取纤维素酶。这样虽利用了残渣，并能缩短发酵周期，但不能提高酶活。并且，更为关键的是，他们是先用纤维素酶来水解天然纤维素，这需要大量的酶，故生产成本颇高，目前难以应用。而且由于利用水解后的天然纤维素残渣生产出来的纤维素酶，其酶活未有明显提高，也影响了这一技术的推广应用。

本发明旨在克服已有技术的不足，利用天然纤维素类物质发酵生产纤维素酶的过程中残留下来的发酵残渣，复又用来代替培养基中的天然纤维素类物质，来制取纤维素酶，其既能变废为宝，使发酵残渣重新得以利用，克服由此带来的污染问题，又能成倍地节约发酵用原料，降低生产成本，同时还能生产出活性更高的纤维素酶。

真菌纤维素酶是诱导酶，木霉能很好地利用葡萄糖等易被吸收、利用的低分子碳水化合物，但生产出的纤维素酶活性却很低。为了生产高活性纤维素酶，通常把纤维素酶的诱导物质-天然纤维素作为培养基的碳源使用。尽管天然纤维素类物质是比较难以分解、利用的，但天然纤维素类物质对纤维素酶却具有较强的诱导作用。一般认为，利用木质素的含量越高的，纤维素的结晶度越高的，越难被微生物分解、利用的天然纤维素物质，所生产出的纤维素酶的活性亦越高。应用天然纤维素物质做碳源，培养木霉，生产纤维素酶时，微生物在生长发育过程中，把天然纤维素中易被吸收、利用的单糖、低分子寡糖及结晶度较低，易被分解利用的纤维素优先分解利用。因而，发酵后剩下来的未被分解利用的发酵残渣中便含有较多的难分解的纤维素和木质素。倘若利用这些在通常情况下难以被微生物分解利用的发酵残渣，来代替培养基中的天然纤维素类物质，进行发酵生产纤维素酶时，便能得到具有更高活性的纤维素酶。同时又可节省发酵原料和解决由于发酵残渣带来的环境污染问题。

本发明使用的菌种有木霉（Trichoderma T和Trichoderma S）、黑曲霉（Aspergillus niger P₁）、及青霉菌（Penicillium Ju）（以上菌株均为本校保存菌种）。

本发明使用的天然纤维素类物质有玉米秸、麦草、稻草、高梁秸等用粉碎机粉成粗糠，此外还有Mandels氏营养液，其组成如下：

（NH₄）₂SO₄～1.4g

KH₂PO₄～2.0g

MgSO₄·7H₂o～0.3g

尿素～0.3g

CaCl₂～0.3g

微量元素：FeSO₄·7H₂O～5mg

MnSO₄·H₂O～1.56mg

ZnSO₄～1.4mg

CoCl₂～2.0mg

水    1l

经发酵后的天然纤维素类物质的残渣，其组成的分析结果，以玉米秸粉为例，列于附表1中。由表1可见，随着天然纤维素类物质的发酵次数的增加，由于低分子糖类及部分易分解的纤维素的利用，使之纤维素含量降低了，总糖量也降低了。而木质素的含量增加了，蛋白质的含量也因菌体蛋白的增加有所增加。

附图为本发明的工艺流程图。其中，1～天然纤维素类物质2～营养液    3～灭菌蒸球    4～发酵室    5～提取罐    6～水    7～酶液

如图所示，将天然纤维素类物质1加营养液2制成发酵培养基，置入蒸球3中灭菌后，冷却、接种，再输送到发酵室4中发酵，发酵完毕，送到提取罐5中，加水6进行抽滤或压榨，将酶液7从发酵物中分离出来，并得到了新鲜的发酵残渣，将这些发酵残渣直接送到灭菌蒸球3中，（或者将其风干备用），通过控制50～75%的含水量，并补加和原培养基相同的营养液2后，重新作为培养基的碳源使用，重复下面的工艺过程。