[发明专利]一种提高绿豆叶肉原生质体分裂频率以培养再生器官的方法

说明书

本发明是一种培养绿豆原生质体，提高该原生质体分裂频率，从而培养再生器官的方法，属于遗传工程领域。

豆科植物的原生质体培养是具有经济价值的豆科作物遗传操作的重要手段。绿豆原生质体培养的研究已有报道〔1〕，〔2〕，但器官发生较难，分化成苗者更未见报道，影响绿豆叶肉原生质体器官发生的原因是多方面的，植物激素是其中最重要因素之一。对于促进绿豆叶肉原生素体分裂频率的研究也未见于报道。

本发明认为影响原生质体培养获得成功的因素是多方面的，但植物的激素是豆科植物原生质体培养中至关重要的因素之一，植物激素在诱导再生细胞分裂和诱导培养物脱分化，形态发生和发育中起着相当重要的作用。本发明的目的在于通过研究植物激素对绿豆原生质体分裂的影响，提供出提高绿豆原生质体分裂频率的方法。

材料和方法

一、试管苗的培育

取绿豆种子为试材，先经海鸥洗涤剂清洗3～5分钟，于70%（V/V）酒精浸渍2～3分钟，在0.1%升汞溶液中灭菌15分钟，用无菌水洗涤3～5次后置于MS基本培养基上，培养基约在1～1.1Kg/cm²压力下灭菌20分钟，接种于培养基上的种子，在26±1℃，1500-2000勒克斯培养条件下每天光照10小时，取培养9～21天试管苗真叶作游离叶肉原生质体的材料。

二、叶肉原生质体的游离和培养

切取幼嫩真叶，剪成1～1.5mm薄片，置入混合酶液内分离原生质体，混合酶液是由0.7%（W/V）纤维素酶（“ONOZUKA”R-10 Yakult Pharmaceutical Industry Co.Ltd.Japan），0.7%（W/V）半纤维素酶（No.H-2125，Sigma Chemical Company，U.S.A）和0.4%（W/V）果胶酶及CPW 13M甘露醇〔5〕组成。PH5.6。酶液经微孔滤器（抽滤膜孔径为0.45μ）灭菌，材料置于26±1℃恒温摇床（45-50转/分）17小时，然后用400目镍网过滤，去除细胞和小细胞团，用离心机（500转/分）离心2分钟收集原生质体，再用CPW 13M溶液漂洗原生质体三次，最后以所试原生质体培养基制成悬浮液，原生质体密度为10⁵-10⁶个/毫升。

将原生质体悬浮液分装到细胞培养瓶（60×30×20mm），每瓶1至2毫升，在27±0.5℃人工气象箱内弱光（200-300勒克斯）下静止培养。

选用D₂A培养基〔3〕（铁盐和微量元素用量按MS培养基）为原生质体培养基，各组成成份列为表Ⅰ，选用生长素2，4-D，NAA，细胞分裂素ZEA，BAP及其它激素GA₃五种植物激素进行各种配比组成试验，每种激素浓度均为0.5毫克/升。在培养7天后，于倒置显微镜下观察计数。原生质体分裂的百分率为分裂的原生质体数/成活原生质体总数×100%，每次计数500个以上原生质体，每种处理重复三次以上。

试验结果

一、单一植物激素对绿豆叶肉原生质体分裂的作用

在培养基中单独添加2，4-D，6BA，ZEA，NAA，GA₃任何一种激素时，原生质体分裂频率均较低（表二），其中2，4-D，BAP，ZEA三组合频率相仿，单一使用NAA与GA₃时，对原生质体生长不利，GA₃不利更加明显。

二、激素组合和激素组的效应

在控制培养组织的分化试验中，激素的组合甚为重要。本发明采用生长素与细胞分裂素结合使用，或同时使用二种生长素，或同时使用二种细胞分裂素（表三），结果表明，不同激素组合的效应有很大差异。按表三所获结果可归纳出如下几点：

1.在培养基中添加一种生长素（为便于分析，把GA₃归为生长素类）和一种细胞分裂素时，不同组合间激素效应畋鸷苊飨浴Ｉに?，4-D与细胞分裂素ZEA及BAP二类植物激素混合使用时，对原生质体再生细胞的分裂表现了良好的协同作用。

2.NAA无论与细胞分裂素BAP或ZEA相配比时，原生质体分裂频率下降明显，表现了仰制效应。赤霉素在与BAP，ZEA混合时亦相当明显地具有不利影响。