[发明专利]乙肝疫苗的制备方法及其制品

说明书

病毒性乙型肝炎是一种广为流行的疾病。世界上乙肝病毒（HBV）携带者达2亿以上，由乙肝或与乙肝有关的疾病导致的死亡人数巨大，对人类的危害极大。

在某些HBV感染病人的血清中存在42nm的感染病毒颗粒，它由构成病毒外壳的表面抗原（HBsAg）、病毒核心抗原（HBcAg）和病毒DNA组成。除了完整的病毒颗粒外，乙肝病人的血液中还存在着仅含HBsAg的，较小的，直径为20至22nm的球状颗粒和菅状颗粒。HBsAg颗粒能诱导产生专一的抗体，使人体产生抵抗HBV感染的免疫力。但是，从血液中分离HBsAg颗粒的费用昂贵，来源也有限，无法满足HBV高发地区人们普遍接种需要。而且，血液中还存在着未知病因可能造成的不安全性，因此，人们正在积极研究通过其他途径生产乙肝表面抗原。

HBsAg由三种不同大小的病毒外壳蛋白组成。它们由位相相同的连续编码区编码，但由不同的翻译起始位点ATG起始。这三个蛋白是HBsAg主蛋白（或S蛋白），含226个氨基酸，由HBsAg基因的S区编码;少量的中分子蛋白（MS蛋白），是在S蛋白的N端增加了55个氨基酸，含有281个氨基酸。这55个氨基酸是由基因preS2区编码，并含有多聚人血清白蛋白（pHSA）受体;少量的大分子蛋白（LS蛋白），由完整的表面抗原基因，即preS1、preS2和S区共同编码，由约400个氨基酸组成。MS蛋白和LS蛋白主要存在于病毒颗粒的外壳及具有感染活性的病人血清的表面抗原颗粒中。

由于HBsAg颗粒可使人体产生专一性的抗体，对病毒的感染起免疫作用，因此，其生物学特性以及在疫苗研制中的应用引起人们广泛的注意。绝大部分研究集中于S蛋白，但是，近年来对MS和LS蛋白也逐渐引起重视。MS和LS蛋白具有S蛋白所没有的抗原决定簇，用它们作成化学合成疫苗或重组的乙肝疫苗，能使疫苗的效价提高（Milich，D.R.，et        al.，Science[1985]228        p1195-1199）。

痘苗病毒已被用来表达多种病毒的抗原，包括HBV。利用重组DNA技术，将所需表达的蛋白基因插入痘苗病毒，用所得到的重组痘苗病毒感染适当的细胞，使该蛋白基因得到表达。重组病毒本身可以用作活疫苗。另一方面，重组病毒可以在细胞中复制、表达，并可能分泌所需抗原而用作亚单位疫苗。

Cheng等（J.Virol，[1986]60，p337-344）描述了一个重组痘苗病毒的构建。该重组病毒含有编码大分子乙肝表面抗原（LS）的DNA顺序，即完整的HBsAg基因，在一个痘苗病毒启动子的调控下表达。它们用重组痘苗感染CV-1细胞，虽然在细胞内有LS蛋白的合成，但是，被感染的细胞显然并不分泌LS蛋白。更明确的是Moss和Flexner（Annual        Review[1987]5        p305-324）指出，HBsAg的大分子蛋白不能形成颗粒而分泌，而且，如果同时用两个重组病毒感染细胞，LS甚至会影响HBsAg主蛋白的分泌。Paoletli等（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.[1984]Vol.81，p193-197）对于使用重组痘苗病毒构建预防乙肝和疱疹的潜在活疫苗进行了描述。他们报导了乙肝表面抗原能够合成并从感染的细胞中分泌出来，但是，没有报导乙肝表面抗原的三种不同组分以及它们的分泌。在他们的工作中，带有全表面抗原基因的重组痘苗病毒表达的HBsAg很低，经RIA检测，仅为只含主蛋白基因的重组病毒的几千分之一。

本发明的目的在于提供一个能有效地阻断乙肝病毒感染的新型重组疫苗。提供一个带有完整的HBsAg基因的重组痘苗病毒。它能够表达并分泌乙肝表面抗原颗粒，并含有乙肝表面抗原的所有三种组分，S、MS蛋白和LS蛋白。同时含有S、MS和LS的HBsAg的抗原性比仅含S的要强得多。它能在体内迅速产生防止乙肝病毒感染所需要的全谱抗体，因而为发展高效、速效的乙肝疫苗提供了基础。本发明所提供的重组痘苗病毒也使人们可能获得大量的S蛋白、MS蛋白和LS蛋白，制备新型的亚单位疫苗。