[发明专利]多孔无机膜载体及其使用方法

说明书

本发明涉及适于动植物细胞生长的多孔无机膜载体的使用方法。某些细胞如成纤维细胞和转化细胞比较容易进行培养。这些细胞可在各种固体表面（如塑料或玻璃）上附着并增殖，甚至能够悬浮生长。但其它一些哺乳动物细胞如来自上皮组织的分化细胞却必须固着，因而难于生长。（分化细胞是具有特定功能特点的细胞。多细胞生物体内的大多数细胞都是分化细胞，例如哺乳动物的血细胞、神经细胞和肌肉细胞）。而且，如果在不透性的表面上培养上皮细胞，则不可能发育出分化特性。

然而，现已发现，如果在渗透性载体上培养上皮细胞，则该细胞可以产生分化。这可以归因于渗透性载体使得细胞可通过上下两个表面来获得养分这样一个事实。

有人描述了在组织培养中用膜作为角质细胞（Keratinocyte）的载体（F.L.Vaughan，R.H.Gray    and    I.A.Bernstein，In    Vitro    Cellular    and    Developmental    Biology，22，141-149，1986）。作者观察了角质细胞在各种合成有机膜上接种并培养后其原始培养的附着、增殖和分化情况。在两种膜上没有达到满意的附着。为组织培养操作而特别制备的膜的支持附着和增殖的能力，与用作对照的塑料培养容器相同或更强。所试验的三种透明膜中，没有一种能够象用作对照的塑料培养容器一样支持附着和增殖。如果用粘连蛋白预涂这些膜，则所获结果略好些。

一方面，本发明提供一种支持细胞生长或保持细胞于其上的多孔无机膜载体。另一方面，本发明提供一种培养或保持细胞的方法，它是将细胞培养物涂到一种多孔无机膜载体上，然后将该细胞保持在一定条件下，使其在此载体上生长。

使用无机膜载体的优越之处在于，它们一般是惰性的并且对细胞无毒，而且通常可进行加热或用其它方法灭菌而不会损坏之。膜载体可由多种材料制成，包括金属氧化物如氧化锆，而氧化铝则更好。在一些文献中介绍了这种多孔无机膜。例如，氧化铝及其它金属氧化物膜可以用溶胶-凝胶技术来制备（A.F.M.Leenaars    et    al.，Journal    of    Material    Science，19（1984），1077-1088）;或利用带铸（tape-casting）技术来制备（R.E.Mistler    et    al.，Ceramics    Processing    Before    Firing，411-448，ed.G.Y.Onoda    et    al.，Wiley，N.Y.，1978）。多孔膜可以采用EPA224443和224444所述的方法来制备。最好采用阳极氧化铝膜。

当铝基质在某些电解液如稀硫酸中阳极化时，在其表面形成多孔阳极氧化物膜，大部分是由无定形氧化铝构成的。这些孔从膜的外表面延伸到接近金属/氧化物的界面。与金属/氧化物界面相邻的是一层薄的阳极氧化物粘附层（氧化物保护层）。阳极氧化物膜可从金属基质上分离下来，而在该基质上可采用几种技术成膜，所有这些技术都能产生具有通常为圆柱状孔的对称膜，这些孔从一个表面延伸到另一个表面，并且在其整个长度上通常具有均匀的直径。

EPA178831描述了制备多孔膜的方法，即，利用缓慢降压技术将常规的阳极氧化铝与其金属基质分开，这一技术旨在使保护层变薄，最终使处在金属/氧化物界面的所有剩余的保护层溶解。所得到的不对称阳极氧化铝膜具有从膜的一个表面延伸至另一表面的孔，包括一些较大的从某一表面伸入的孔，与一些较小的从另一表面伸入的孔互连。

剥离的多孔阳极氧化铝膜，不论是对称型的还是不对称型的，都由于具有下列性质而特别适于作组织培养载体：

-它们是高度多孔的;

-它们通常是透明的，因此允许在原位对细胞进行显微镜观察;

-它们是光滑的;

-它们是刚性的，因此便于机械转移完整的细胞单层;

-它们是无毒的;

-它们不易受有机化学药剂的作用，这对处理细胞以便进行观察可能是很重要的;

-它们是可灭菌的，例如通过高压灭菌或利用紫外或γ辐射灭菌。