[发明专利]促进变性剂溶液中所含的重组蛋白形成分子内二硫键的方法

说明书

本发明一般涉及促进二硫键形成的方法，特别涉及促进变性剂溶液中所含的还原型重组蛋白形成分子内二硫键的方法。

产生重组蛋白的方法是本领域内所熟知的，即将编码所需蛋白的DNA插入宿主微生物中，在能表达重组蛋白的条件下培养该微生物。然而，这些重组蛋白一般并非以易于回收并具有生物活性的形式产生。重组蛋白常以含有无生物活性的寡聚体和聚集体蛋白的“内含体”的形式产生。这些内含体必须进行加工才能产生有生物活性的单体蛋白。

加工内含体以回收有生物活性形式的蛋白质有许多不同的方法。不溶性内含体一般从微生物细胞中回收并溶于强变性剂或去污剂中。所得的溶液含有变性及还原形式的所需蛋白。为了得到有生物活性的蛋白，必须恢复天然分子特有的三级结构。这一般涉及使变性蛋白重新折叠及氧化先前还原的巯基形成二硫键，从而维持重组蛋白的三级结构使其具有生物活性。

获得有生物活性的三级结构的现有方法一般包括，除去变性剂或去污剂，使蛋白重新折叠成有生物活性的构象。该方法一般包括一个氧化还原型巯基形成二硫键的步骤，所形成的二硫键有助于维持该分子的三级结构。

蛋白的复性及正确二硫键的再形成是一个困难且不可预测的方法。如果除去变性剂并形成二硫键，可形成与天然或重组分子的生物活性不一致的三级结构。有可能形成分子间二硫键而产生寡聚体和聚集体并破坏相互连接的分子的生物活性。也可能形成不正确的分子内二硫键而使分子呈无生物活性的三级结构。

回收重组蛋白和氧化巯基而在重组分子内形成二硫键有许多不同的先有技术方法。美国专利第4，511，503号和4，518，526号（Olson等）及美国专利第4，511，502号和4，620，948号（Builder等）公开了一些方法，其中，将内含体溶于强变性剂和还原剂中，从溶解蛋白的溶液中除去污染物，再用弱变性剂代替强变性剂，利用分子氧和催化剂（一般为金属阳离子或连四硫酸钠），借助将巯基氧化成二硫键使蛋白质得以重新折叠。然而，这些氧化巯基而形成正确的二硫键的方法的缺点是很慢，因为分子氧得自大气，一般需要使溶液暴露在大气中放置3至8天。此外，这些方法一般只有在强变性剂被稀释、除去、或被弱变性剂取代以减小其对蛋白结构的影响之后，才能形成二硫键。其它缺点包括反应的不可预测性;当溶液暴露在空气中放置有可能滋生细菌或造成其它污染;随着溶液长时间放置（一般在1星期以上）而形成寡聚体和聚集体;等等。

美国专利第4，530，787号（Shaked等）公开一种以受控方式氧化含半胱氨酸的还原型微生物蛋白而产生合成蛋白如IL-2的方法，这种合成蛋白与其天然对应物有同样的二硫桥。氧化反应以邻亚碘酰基苯甲酸作为氧化剂。

美国专利第4，569，790号（Koths等）公开了一种方法，该方法利用邻亚碘酰基苯甲酸选择性地氧化重组IFN-β和IL-2蛋白而形成与天然分子一致的二硫键。

美国专利第4，572，798号（Koths等）公开了一种方法，该方法利用Cu⁺²离子选择性地氧化重组IFN-β和IL-2蛋白而形成与天然分子一致的二硫键。进行氧化反应的溶液中含有使蛋白保持溶解所需的最低量的变性剂。尽管据报道利用铜离子的反应进行得很快（约1小时），但该方法有一个缺点，即注入溶液中的铜离子可能会使铜离子和蛋白间产生一些不必要的相互作用。此外，铜离子起到催化剂的作用，由于迅速形成二硫键，可产生不正确的分子内二硫键而出现无生物活性的寡聚体和聚集体，也可产生不正确的分子内二硫键而出现无生物活性的单体，这些单体对所要求的目的并不适用。

因此，需要一个能促进变性剂溶液中所含的还原型重组蛋白形成分子内二硫键的方法。该方法应在较短时间内氧化巯基，产生高产的、有生物活性的单体蛋白，并减少由于形成不正确的分子内二硫键和形成分子间二硫键而产生的无生物活性分子。

因此，本发明的一个目的是，提供一种促进变性剂溶液所含的还原型重组蛋白形成分子内二硫键的方法。

本发明的另一个目的是，提供一种促进变性剂溶液中所含的还原型重组蛋白在约6-48小时的时间内形成分子内二硫键的方法。

本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法利用可产生高产的、有生物活性的单体重组蛋白的方法促进变性剂溶液中所含的还原型重组蛋白、形成分子内二硫键。

本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法利用可减少由于形成不正确的分子内和分子间二硫键而产生的无生物活性的重组蛋白的方法，促进变性剂溶液中所含的还原型重组蛋白形成分子内二硫键。

本发明进一步的目的是提供一种促进变性剂溶液中所含的重组生长激素形成分子内二硫键的方法。