[发明专利]蛋白质纯化方法

说明书

离子交换层析是一种常规的层析技术，该技术性质温和，成本低，容量大，且易于测量。然而，迄今尚没有一种技术可用于从蛋白质尤其是rDNA蛋白质中分离去除密切相关的杂质。

人重组GM-CSF就是这样一种rDNA蛋白质的例子。GM-CSF是一些支持血液中的粒细胞和巨噬细胞生长发育的因子，最近有几个实验室已克隆了GM-CSF的互补DNA(cDNA)并进行了顺序测定。此外，已从M_o细胞系的培养上清液中纯化出了非重组GM-CSF(见美国专利4,438,032)，并测定了N末端头16个氨基酸的顺序(Gasson et al，Scence，226：1339-1342，1984)。在人的各种GM-CSF中，观察到了核苷酸顺序和氨基酸顺序的不均一性。例如，在氨基酸水平上，在距N末端丙氨酸100位处，既观察到了苏氨酸，也观察到了异亮氨酸，说明在人群中，GM-CSF可以有几种等位形式或多种类型。

目前有许多从头制备和克隆cDNA(如GM-CSF的cDNA)及构建cDNA文库的方法。举例来说，可从产生具有所需活性的多肽的细胞(如未转化的人T细胞)中提取总mRNA。可以利用引物启动的反转录由该总mRNA构建双链cDNA，首先合成每个mRNA顺序的互补链，然后再利用引物合成第二条链。随后，可对cDNA进行克隆，即，通过互补均聚物尾巴或由含适当限制位点的连接子片段产生的粘性末端，将cDNA连入合适的质粒或噬菌体载体中，然后转化合适的宿主。可用范围广泛的表达系统(即宿主-表达载体的结合体)来产生利用本发明方法纯化的蛋白质。可能的宿主细胞类型包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等，但不限于此。

已公开了从宿主细胞中提取GM-CSF并随之将其纯化的各种方法，但GM-CSF并不总是以良好产率并同时保留生物活性而被充分纯化的。

本发明的目的是将一粗蛋白分离成较纯的蛋白组份和杂质蛋白组份的方法，其特征为在使纯化蛋白和杂质带相反电荷的pH下，使粗蛋白与离子交换树脂接触，其中一个组份选择性地结合到离子交换树脂上。离子交换树脂最好是强离子交换树脂，而且最好是纯化蛋白组份结合在离子交换树脂上。结合在离子交换树脂上的组份最好以洗脱方式进行收集。    

粗蛋白的pH最好调到待分离组份的等电点范围，以便放大组份间净电荷的差别。

本发明的另一目的是测定可将粗蛋白分离成较纯蛋白组份和杂蛋白组份的pH的方法，其特征为测定待回收纯蛋白和待除去杂蛋白的等电点，以及在等电点范围内测定纯化蛋白和杂质带相反电荷的pH，在该pH下并且存在有所述电荷之间的放大的差别。蛋白组份的等电点最好由计算机模拟测定，或利用等电聚焦电泳测定。

上述方法可用于纯化rDNA蛋白，具体说是粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，更具体说是通过使之与Δ4GM-CSF分离而纯化GM-CSF。

在一个具体的优选方案中，蛋白质的纯化通过使蛋白质依次接触下述物质进行：

A.阴离子交换树脂如四级胺树脂，它最好与交联葡聚糖、纤维素、琼脂糖或丙烯支持物连接；

B.阳离子交换树脂，最好具有与交联葡聚糖、纤维素、琼脂糖或丙烯支持物连接的磺酸官能团；

C.凝胶过滤装置，最好能够分离约5,000到100,000道尔顿的蛋白。

本发明涉及用以纯化粗蛋白的高分辨率离子交换层析分离技术，特别是粗rDNA蛋白。在该项技术中，层析在待回收的纯蛋白及待除去杂质的等电点附近进行，最好是在可放大纯化蛋白和杂质间电荷差别(如最大值)及使分子带相反电荷(极性化)的pH下进行。此放大的净电荷差别仅在等电点附近发生，它可用来选择合适的离子交换层析条件，使得在几乎不带电荷时也能发生与离子交换树脂的选择性结合。为方便起见，该技术此后称为得尔它等电点(DIP)层析。

通过下列技术将与所需rDNA蛋白紧密相关的rDNA杂质从粗蛋白中除去是很困难的，这些技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析，疏水作用层析、反相高效液相层析、金属螯合亲和层析及其它常规类型的层析。这些与所需蛋白紧密相关的杂质，通常是与所需蛋白的分子量和电荷分布非常接近的蛋白质，它们通常缺少一个(或多个)带电荷的氨基酸。这些杂质的例子有由切下一个易被水解并易受层析相互作用的肽末端而形成的蛋白降解产物。这种杂质通过常规的离子交换层析是很难分离的。