[发明专利]鸡败血支原体油乳灭活苗的制备方法

说明书

本发明是一种鸡败血支原体油乳灭活苗的制备方法，可用它来制备油乳灭活苗来预防鸡败血支原体病。

鸡败血支原体是一种广泛存在而危害严重的鸡的呼吸道传染病，感染后可影响鸡的产肉和产蛋，并能诱发其他疫病，它给养鸡业造成了严重的经济损失，国内一直没有该疫苗的生产技术。据国外Aviaw    Diseases    Vol.29    No2报道H.W    Yoder等（1985）制备的鸡败血支原体油乳灭活苗，其制备方法是用MG的R菌株在Frey′s培养基上于37℃培养24小时，然后用12000G离心30分钟，经三次洗涤后，加入0.1%的β-丙内酯于室温灭活3小时，用PBS配成细菌悬液抗原。配苗时，在每90ml抗原液中加吐温80    4ml作为水相，并以Drakeol    6    VR油360ml加司盘80    40ml作为油相，并以水1油2的比例在搅拌器中乳化制成油乳灭活苗。

Frey′s培养基的成分：

支原体肉汤基础（ALbimi牌的商品）    22.5g

Eagle氏必需维生素液浓缩100倍    25.0ml

葡萄糖    10g

猪血清    120ml

盐酸半胱胺酸    0.1g

氧化    NAD    0.1g

酚红    25mg

蒸馏水    1000ml

但该制备方法，配方复杂，价格高。

本发明的目的是制备鸡败血支原体油乳灭活苗，预防鸡败血支原体病，免受经济损失。

制备鸡败血支原体油乳灭活苗，首先利用具有广泛抗原性的S₆菌株通过易感动物培育其免疫性，其次是将菌种通过培养基培育获得大量的支原体培养物，制出菌体悬液，第三是将此悬液按比例与白油乳化混合。

下面详细叙述制备鸡败血支原体油乳灭活苗的方法。

1、菌种的定向培育

将支原体菌种旺盛生长期的培养物通过鸡胚卵黄囊10代，使其成为具有高毒力，高抗原性的特点。

2、培养基

分基础培养基和使用培养基二部分，用以获得支原体的大量生长物。

（1）基础培养基成分：牛心汤1000ml，1%酚红0.25ml，蛋白胨10g，氯化钠5g，烟酰胺200mg，调PH值至7.8-8.0，用培养瓶分装后，10磅压力高压灭菌20分钟。

在基础培养基中加入烟酰胺，取代二磷酸吡啶核苷酸（DPN），可使抗原量增多。烟酰铵具有耐高压的特点，使培养基稳定。烟酰胺价格便宜，使用方便。烟酰胺不仅可取代辅酶I及盐酸半胱氨酸，而且在不使用酵母制剂的情况下，也可获得良好的生长发育。

（2）使用培养基成分：在基础培养基中添加下列成分，马血清15%，葡萄糖0.5%青霉素800单位/ml，醋酸铊1/4000，25%的酵母浸出液加入4%。

3、抗原制备

（1）将已发育良好的支原体生长物种入使用培养基中，恒温温箱培育24小时后，滴加20%NaoH溶液，调整培养液的PH值至8.0后，继续培养，至48小时再滴加20%的NaoH溶液，调整培养液的PH值至8.0，继续培养至72小时收获。细菌生长过程中PH值降低，不利于细菌的生长，调整PH值有利于细菌的生长。

（2）菌液制备

将72小时培养液以8000G离心30分钟，弃去上清，再加无离子水，摇匀，再以8000G离心洗涤沉淀物一次，然后用P·B·S（0.1M，PH7.0）稀释至原培养液量的1/10，并加入福尔马林使最终福尔马林浓度为0.3%，室温过液。

（3）O·D值测定：取少量已稀释的菌液，用P·B·S作倍量稀释，用光密度计测其O·D值，该值达至0.75时可认为菌数合格。

4、佐剂

每1000ml佐剂中含有下列成分：7-11号白油900ml、吐温85    24ml、司盘85    76ml，该佐剂经消毒后备用。

5、制备

将已稀释菌数合格的菌液作为水相与佐剂以1∶1的量在磁搅拌器上以每30分钟搅拌50ml量的速度搅拌结合，结合后即为菌苗成品，呈结白均匀，长期放置也不分层。

用本发明制备的防疫疫苗效果很好，可确实预防鸡败血支原体病的发生。雏鸡于7-15日令颈部皮下接种该菌苗0.2ml后，即可产生至少5个月的保护力，蛋鸡接种后至上笼时再接种0.5ml，即可在整个产蛋期间具有抗病能力。该疫苗能在普通冰箱保存4-6个月不影响效力。

本制备鸡败血支原体油乳灭活苗的方法培养基配方比Yoder等用的Frey′s培养基配方简单，价格便宜。Yoder等用β-丙内酯灭活苗，用Drakeol    6    VR油作油的主剂，我们用甲醛灭活苗，用工业白油作油相的主剂降低了成本。Yoder等用12000G离心，我们用8000G离心，因此，我们对离心机规格的要求比较低。Yoder等将乳化剂分开配置于各相中，我们则集中加入油中，使乳化工作简化。并采用85产品加强乳化作用。