[发明专利]新型化合物

说明书

苏云金芽孢杆菌（Bacillus    thuringiensis）是一种能产生孢子的细菌，它在无性生长阶段的末期产生一种蛋白晶体δ-内毒素。此内毒素由某些昆虫吞食后产生毒性效应，包括停止进食、胃肠功能失常、脱水并最终导致死亡。δ-内毒素通常是由一质粒来源产生的一种无活性的前体或前毒素，分子量为130，000-140，000道尔顿（Calabrese，Canad，J.Microbiol.26∶1006，1980）。此分子在昆虫肠道内，通常由于肠道蛋白酶的水解作用而被切除掉C-端的大约一半，可能还切掉N-端的若干氨基酸，而这正是产生分子量为65，000-70，000道尔顿的活性毒素所必须的（Tyrell等，J.Bacteriol.145∶1052，1981）。

已经鉴定了苏云金芽孢杆菌的大量亚种。虽然其中的大部分对于鳞翅目昆虫具有更大的特异性或增强的毒性，但也有一部分表现出对于其他类昆虫的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌以色列亚种（B.t.israelensis）具有针对双翅目幼虫（蚊子和墨蚊）的毒性，最近还证明，另外两个亚种具有针对鞘翅目幼虫的毒性（Hofte等，Nuc.Acid.Res.15（17）：7183，1987）。

虽然已做了大量工作以生产活性毒素及其结构基团，但对于苏云金芽孢杆菌δ-内毒素顺序中的活性或毒性部分抵抗点突变的能力，以及这种突变对于毒素分子活性的影响，人们了解得似乎比较少。

本发明的目的之一是在苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的活性部分提供新的突变种。

本发明的进一步的目的是产生这样的突变：它们能有效地使截断的和完整长度的δ-内毒素两种形式都产生类似苏云金芽孢杆菌内毒素的活性。

本发明的另一目的是提供能增强苏云金芽孢杆菌δ-内毒素杀虫活性的突变。

根据本发明，我们使成百上千的DNA链随机产生了单个和多个点突变，这些DNA链编码典型的具有鳞翅目杀虫活性的苏云金芽孢子杆菌内毒素活性部分的一大段，然后通过重组技术分离并产生了若干突变的苏云金芽孢杆菌内毒素，它们表现出野生型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素所具有的针对鳞翅目的杀虫活性特征。而且还表明，在这些被发现的突变点处，能够置换编码任何其他天然氨基酸的密码以产生活性内毒素蛋白。还发现一些随机突变产生更强的杀虫活性。这种活性可以根据后面所述的方法加以证明，例如美洲菸夜蛾（Heliothisvirescens）检测法或粉蚊夜蛾（Trichoplusia    ni）检测法，在许多情况下，这种增强非常显著，其活性比母体内毒素结构至少高出两倍或更多倍。还分别对多突变（每条突变的DNA链通常2或3个氨基酸）单独及以不同组合进行了评价，以鉴别出那些更有效的突变及其组合。除了一个例子以外，还发现本发明的突变都存在于在大量野生型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素中高度保守的氨基酸顺序内，因此表明是本发明提供的突变作用具有广泛的适用性，它能用于大量在这种保守区域内提供了具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌内毒素的内毒素结构。