[发明专利]测定可免疫检测物质的方法及适用于此的反应容器

说明书

本发明涉及一种免疫学检测方法，即通过使用结合有一种免疫活性反应组分的固相，根据异源免疫检测法测定可免疫检测的物质，还涉及适用于此的反应容器及标准反应容器的使用。

免疫检测法通常被用来测定能被特异结合的物质。在本方法中，使能够相互特异结合的结合对的一个成员与其通过已知方法标记的特异性受体反应。然后，进一步使这两种物质的结合物与一受体反应，此受体特异于结合物或其两个成员之一。可采用许多方式来进行这类免疫学检测。在这类方法中，最好是使受体之一与固相结合。这有助于使结合的和未结合的反应成员分离。在测定能被特异结合的物质时，根据已知方法测量与固相结合的标记的反应成员的量，或测定存在于溶液中的标记的反应成员的量，并计算待测的反应成员的量。

在免疫学方法中通常作为固相使用的有塑料试管或微量滴定板，其内表面结合有反应成员，或反应成分结合在其外表面的小球体。

在这些方法中，特异性反应成员与不同表面的结合必须以这样的方式进行，即它在结合后不丧失与能与其特异结合的物质进行特异性结合的能力。由于此原因，反应成员通常通过吸附作用结合于固相。因此，已有建议指出，反应成员与固相的结合应当通过介导结合作用的偶联剂进行。在此方法中，应当注意不要使反应成员与结合剂的结合破坏分子中进行特异性反应的区域，或者说应使反应成员以这样的方式结合，即使其反应位点背对固相并向着它的结合成员。

所有这些已知方法的缺陷是必须为每种特异反应提供专门的固相。这意味着对每个单独的测试来说，必须制备和贮存另一种固相，然后用来进行测定，这些步骤是很繁琐费时的。

因此，本发明的目的是提供一种方法和一种适用于许多不同的检测法的反应容器。在日常的临床诊断中，由一份血液样品测定许多不同的参数，例如激素、肿瘤标记等，并测定感染、过敏性或受孕等的参数。待测参数的浓度范围很广。低浓度参数如TSH和催乳激素的范围是10^-10-10^-12mol/l，而高浓度参数如T₃和T₄的浓度大约为10^-7-10^-8mol/l。就此而言，每次进行单项测定时最好不必使用不同的试管，而是能够在所有测定中使用一个标准的反应容器。

此目的是通过一种免疫学检测方法达到的，即通过使用结合有一种免疫活性反应组分的固相，根据异源免疫检测法测定可免疫检测的物质，其中使用一种反应容器作为固相，其内表面结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，结合量为每毫升反应体积有0.1～2.5μg。所列数量是指在免疫反应过程中，可由结合成员（其形式为生物素化的蛋白质或半抗原）接近的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。

本发明的方法适用于所有的测定法，其中，受体可以是抗体或抗原，使它固定于固相上并与生物素结合。本发明与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白能很好地粘附于所有的试管材料，而且这种结合对于洗涤剂是稳定的。在对许多免疫学方法进行评价时都需要建立标准曲线，在此过程中，与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白产生很陡的标准曲线，而空白的读数很小，因此提高了精确度。另一优点是，每批之间所包裹的抗生蛋白链菌素量的差别对测量结果只有可以忽略的影响。本发明方法的特别突出的优点是，可以调节与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的量，从而使它能够用于所有已知的以异源免疫检测法为基础的方法。进一步的优点是可用本发明的方法同时测定好几种物质，尤其是抗体，但也包括抗原。实例7将对此作更详细的说明。

在一个尤其优选的具体方案中，用作固相的反应容器可同时用作对标记进行光度学测定的小杯。这一点是尤其有利的，因为进行所有的反应时只需使用一个容器。在这种情况下，所制造的反应容器在相互对立的两面应当具有光学透明的壁。所有的壁区域都可以用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白包裹。

根据本发明，用作固相的反应容器在其内表面上结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。通过现有技术的方法（EP122209）进行抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的结合。抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白可以直接结合在固相上，或也可以通过间隔物或介导结合作用的物质进行结合。

在本发明优选的具体方案中，使抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白与分子量高于大约500000的可溶性蛋白偶联，然后根据例如专利申请P3640412.8所述方法，使此结合物吸附于流水性固相上。优选使用已经使之具有疏水性的蛋白质。