[发明专利]制备由肝炎病毒因子产生的蛋白质的方法

说明书

本申请是1988年6月17日提交的208,997号美国申请的后续部分，该申请被作为本文的参考文献。

本发明涉及重组蛋白、基因和基因探针，更具体地说，涉及由肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子产生的这种蛋白和探针，并涉及利用这些蛋白和探针的诊断方法和疫苗应用。

据报导，在亚洲、非洲和印度次大陆，肠道传播性非甲非乙型(ET-NANB)肝炎病毒因子是许多流行性和零星性肝炎病例的病因。传染作用通常是通过粪便污染的水体进行，但该病毒也可通过密切的物理接触传播。端毒似乎并不会导致慢性感染。通过用收集的粪便分离物感染志愿者，已经证实了ET-NANB病毒的病原学；免疫电镜(IEM)研究表明，来自感染个体粪便的病毒颗粒直径为27-34nm。病毒颗粒能与来自不同地理区域感染个体的血清抗体反应，这一现象提示，全球范围的ET-NANB肝炎中有大部分是由一种病毒因子或类别导致的。在由血液传播性NANB病毒感染的个体的血清中，没有观察到抗体反应，表明两种NANB型之间具有不同的特异性。

除了血清学差别以外，这两种NANB型感染还显示出各自的临床差别。ET-NANB的特征是急性感染，通常伴随有发热和关节痛，以及肝门发炎，还伴随有肝脏活体解剖样品中的胆汁阻塞(Arankalle)。症状一般在六周内消退。与此相反，血液传播性NANB在大约50％病例中都是慢性感染。很少观察到发热和关节痛，炎症则主要分布于实质细胞中(Khuroo，1980)。根据对于灵长类宿主的感染性也可区别这两种病毒因子。ET-NANB能够传染犬猴(Cynomolgusmonkeys)，但血液传播性因子不能。血液传播性因子比ET-NANB更易传染黑腥腥(Bradley，1987)。

为了鉴别和克隆与ET-NANB肝炎相关的病毒基因组顺序，在全球范围内已作出了大量努力。努力的目标之一是鉴别病毒及其蛋白产物并确定其特征，这需要有病毒特异性的基因组顺序。另一目的是生产重组病毒蛋白，它能够用于以抗体为基础的诊断法和疫苗。尽管作出了这些努力，但迄今为止，还没有成功地鉴别出与ET-NANB肝炎相关的病毒顺序，也没有鉴别或生产出任一种病毒特异性蛋白。

本文引用的相关文献如下：

     Arankalle，V.A.，et al.，The Lancet， 550(March 12，1988).

     Bradley，D.W.，et al.，J Gen. Virol.， 69：1(1988).

     Bradley，D.W. et al.，Proc. Nat. Acad. Sci.，USA，84：6277(1987).

     Gravelle，C.R. et al.，J.Infect.Diseases，131：167(1975).

     Kane，M.A.，et al.，JAMA， 252：3140(1984).

     Khuroo，M.S.，Am.J.Med.，48：818(1980).

     Khuroo，M.S.，et al.，Am.J.Med.，68：818(1983).

     Maniatis，T.，et al.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982).

     Seto，B.，et al.，Lancet，11：941(1984).

     Sreenivasan，M.A.m et al.，J.Gen.Virol.，65：1005(1984).

     Tabor，E.，et al.，J.Infect.Dis.，140：789(1979).

本发明提供了新的组合物、组合物的制备方法和应用，所述组合物包括来自ET-NANB病毒因子的病毒蛋白和其片段。制备ET-NANB病毒蛋白的方法包括分离ET-NANB基因组顺序，然后将其克隆并在宿主细胞中表达。所产生的重组病毒蛋白可用作诊断剂和疫苗。基因组顺序和其片段可用来制备ET-NANB病毒蛋白，并可用作病毒检测的探针。

图1显示了用以获得克隆的ET-NANB片段和测定其顺序的载体构建和操作过程：

图2A-2B显示了Southern杂交印迹，其中，使放射性标记的ET-NANB探针与扩增的cDNA片段杂交，所述cDNA片段是用从感染的(I)和非感染的(N)胆汁来源(2A)、以及从感染的(I)和非感染的(N)粪便样品来源(2B)分离的RNA制备的。