[发明专利]制备去-B30-胰岛素和去-B30-胰岛素衍生物的方法

说明书

为治疗糖尿病需要相当大量的人胰岛素。

工业上获得人胰岛素主要靠由猪胰素起始的半合成方法。猪胰岛素的区别仅仅是胰岛素B链末端的C-末端处单个氨基酸的不同，对所有L-型胰岛素来说，占据猪胰岛素B30位的是丙氨酸（Ala），而占据人胰岛素的是苏氨酸（Thr）。

因此，以猪胰岛素为原料，通过用苏氨酸置换B30位的丙氨酸就可得到人胰岛素。这种置换主要是通过两类方法进行：“一锅煮法”和“两阶段法”。

在“一锅煮法”中，以一步法由苏氨酸基取代猪胰岛素的B30-丙氨酸基（肽基移转作用）。

在“两阶段法”中，第一阶段是B30-丙氨酸消去（蛋白水解），第二阶段是苏氨酸衍生物连接上（偶联反应）。

在“一锅煮”和“两阶段”两种方法中，苏氨酸通常是以衍生物的形式使用（具有保护基）以便在肽基移转偶联后需脱保护基。

在两阶段法中的第一阶段由猪胰岛素形成的去B30-丙氨酸猪胰岛素的生物活性与人胰岛素的差别极微，这第一阶段通常是在酶，例如羧基肽酶A的存在下进行的。然而，酶不仅导致（所希望的）B30-丙氨酸消去，而且也导致A链（Azl        Asn）的C-末端天冬酰胺的（不希望的）消去。这就是为什么需要选择反应条件从而使B30丙氨酸的消去尽可能完全，而对A21天冬酰氨的攻击尽可能接近于零。根据E.W.Schmitt，H.G.Gattner，Hoppe-seyler′s Z·生理化学杂志，359卷，799-802页（1978）的方法，主要靠NH⁺₄离子的存在而达到此目的。据该引文所包括的步骤，这个方法是在碱性，特别是在PH8.3的水溶液中，在低浓度底物，特别是在5mg猪胰岛素/ml的情况下进行。使用的酶是羧基肽酶A;酶/底物比是1∶100（按重量计）。

然而，A21天冬酰胺与B30丙氨酸间竞争性消去是明显不完全的，至少未完全到所要求的量，甚至受所存在的NH⁺₄离子所抑制。这由EP-A0，017，938可明显看到;这包括使用E.W.Schmitt和H.G.Gattner中的某些例子的方法（上述引文中），其中不是结果不明确，就是仍然得到明显量的去A21天冬酰胺的产物。

在实例1中（12/13页）猪胰岛素在PH8.3水溶液中，NH₄HCO₃存在下，底物浓度5mg/ml（酶：羧基肽酶A）时反应转化率充其量在77%范围。报告的产量为460mg＝92%。

然而，如果反应进行其转化仅仅在77%的范围，那么从纯理论来讲是不可能的，因为这将大于所产生的去-B30-丙氨酸产物仅为大约385mg的最大产量（所用的猪胰岛素的77%的量）。因此，该例子是不正确的，不能获得关于实际抑制A21-天冬酰胺消去的结论。

相反，在EP-A中16页第一段的例子是更正确的。在这个例子中，200mg牛胰岛素在NH₄HCO₃缓冲液中，底物浓度为5mg/ml时与羧基肽酶A孵育过夜。据说这要产生180mg的产物，即其组成为78%的去-B30-丙氨酸牛胰岛素和22%的去-B30-丙氨酸-去-A21-天冬酰胺牛胰岛素。

牛和猪胰岛素仅在A链的8位和10位不同。因此，可以设想，就B30-丙氨酸和A21-天冬酰胺的消去问题来说，在牛和猪胰岛素之间没有差别。

为制备去-B30-丙氨酸猪胰岛素，我们亲自重复了E.W.Schmitt和H.G.Gattner的制备去-B30-Ala猪胰岛素的方法，所得去-B30-丙氨酸-去-A21-天冬酰胺猪胰岛素的比例大约为所希望的上述EP-A的16%左右。

为了改善猪胰素B30-丙氨酸消去的已知方法，特别是进而抑制与B30-丙氨酸消去相竞争的A21-天冬酰胺消去，现已发现，通过无NH⁺₄离子操作以及用比到目前为止通常用的5mg/ml更高浓度的底物是可能的此外，这个方法不仅对猪胰岛素有用，而且对其他胰岛素，甚至胰岛素衍生物以及天然和非天然的胰岛素前体也是可能的，其中，接着B29的整个肽基（B30肽残基）被消去。