[发明专利]还原型非糖基化重组人体白细胞介素-2的制备方法

说明书

本发明涉及有生物活性的还原型非糖基化重组人体白细胞介素(Interleukine)2(r-hIL₂)的制备方法。

天然的人IL₂是刺激活性T细胞增生的淋巴因子，在其蛋白质的氨基酸顺序中有3个半胱氨酸，位于第58、105和125位。位于58和105位的半胱氨酸由一个双硫键桥连接，而125位的半胱氨酸有游离的巯基(Robb，RJ et al·Proc.Natl·Acad·Sci·USA(1984)81 6486-6490).

通过重组DNA技术，用等位基因或衍生物制备人体IL₂的方法已有文献报道。例如，Taniguchi，T.等人〔Nature(1983)302 305-310〕和Devos，R.等人〔NucleicAcids Research(1983)11 4307-4323〕已描述了人体IL₂基因的无性繁殖及其在微生物中的表达，Ju，C等人(J·Biol·chem(1987)262，5723-5731)已获得了IL₂重组衍生物的表达。此外，已经发现：当IL₂以不溶的颗粒状累积于微生物中时，它是含有3个硫醇基还原型，并且没有活性(Japanese Patent ApplicationJP 1257931)。因此认为：要得到具有活性的IL₂，该颗粒状累积的还原型蛋白必须经过一个氧化过程。为此，将该蛋白溶于变性介质中后，在控制的氧化介质中使之形成一个需要复性的适宜的二硫键桥58-105.还有其它的氧化方法，例如仅用氧气氧化(空气自动氧化)或有铜离子存在的氧气氧化或弱氧化剂存在下的氧气氧化，或用硫醇和二硫化物混合物的氧化(Tsuji，Tetal.Biochemistry(1987)26 3129-3134)。

经氧化复性后，必须经色层析纯化以除去生成的氧化产物异构体，它们包括分子内58-105和105-125键连的异构体及其它分子内键连的异构体，这些异构体无活性，而且可按Wang，A等人〔Science(1984)224，1431-1433〕或Browing，JL等人〔Anal Biochem(1986)155，123-128〕的方法用反相色谱将它们分离。    

因此从颗粒状累积蛋白中制备具有适宜生物活性的同质氧化重组IL₂存在某些技术问题，因为不论采用什么方法都必须有纯化的几个步骤，而这几个纯化步骤使所要产物的产率降低。

本发明方法不需要再氧化便可得到具有IL₂生物活性的产物。

首先，本发明涉及制备非糖基化重组人体IL₂及其等位基因或衍生物的方法，所述IL₂一方面具有下述氨基酸顺序：X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His LeuLeu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu LeuLys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu TyrAla Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe CysGln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr其中X代表蛋氨酸或氢原子，位于58,105和125位的三个半胱氨酸均为还原型；另一方面，所述IL₂的生物活性类似于具有相同氨基酸顺序并在58-105位含有一个二硫键桥的氧化型IL₂。