[发明专利]采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法

说明书

本发明涉及一种采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法，特别是一种利用采集幼龄健康动物的新鲜肝脏，经高速捣碎、匀浆、离心沉淀、薄膜负压透析、正压抽滤除菌等步骤制备肝细胞生长素的方法，属于生化药物的制备方法。

目前国内外都在努力寻找既能阻止肝细胞坏死，又能促进肝细胞再生的物质或药物，先后研究了胰高糖素-胰岛素、前列腺素E₂（PGE₂）和表皮生长因子（EGF）等疗法，自McGowan等（McGowan JA et al：J Cell Physiol 1981;108：353～364）发现胰高糖素-胰岛素和EGF有促进[⁺H]胸腺嘧啶核苷掺入原代培养肝细胞DNA中的作用以来，临床上将胰高糖素与胰岛素联合应用治疗暴发型肝炎（简称G-I疗法）日益增多，但国内外对其疗法的评价尚不统一。Bucher等认为，胰高糖素、胰岛素单独使用无效果，但有加强EGF对肝细胞再生的刺激作用。由于胰高糖素、胰岛素和EGF均不是肝脏本身所产生，因而人们的注意力越来越集中到肝再生刺激因子（HSS）的研究与应用上，因为它是肝脏本身所产生，并已有实验资料证明具有刺激肝细胞再生的作用，将成为一种有希望的治疗急性肝功能衰竭与暴发型肝炎的有效方法。

在1975年LaBrecque从断奶大鼠肝脏按化学法提取肝再生刺激因子（HSS），并证明有明显促进肝细胞DNA合成作用。目前国外已有许多人按LaBrecque法原理，经捣碎、高速离心、加热、酒精提取或柱层析等步骤，生产出各种不同名称的肝细胞生长刺激物质。由于各实验室在动物选用，标本来源，提取方法和结果判定方面不一致，结果相差较大。但从总体分析，上述学者的制备方法工序烦琐，采用的仪器设备成本高，生产产量低，生产周期长，不利于推广应用，且这些产品在临床使用时对人体易引起过敏反应。国内已有用“人胎肝细胞悬液”治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎及肝硬化的报告，并取得较好的效果。但由于“人胎肝细胞”不能长期保存，肝脏供应与病情急需的时间差难于掌握;而且人胎肝脏也奇缺，不利于临床治疗，尚难于在临床推广应用。

本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种结合国内实际情况和临床需要，以幼龄健康动物的新鲜肝脏为原料，采用负压透析法制备肝细胞生长素（HGF）的方法，该制备方法简单方便，易于推广应用，便于大批量生产，而且可选择的原料资源丰富，生产出的肝细胞生长素（HGF）治疗效果好，使用方便。

采用本发明的方法制备的肝细胞生长素（Hepatocye    Growth    Factor，简称HGF）是一种耐热的蛋白质，经用高效液相色谱法分析，活性测定等鉴定，与LaBrecque法制备的肝细胞再生刺激因子（HSS）相似，对治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化有显著的疗效。作为一种耐热的蛋白质的肝细胞生长素（HGF），加热至65℃、15分钟时对活性无影响;甚至加热至100℃、15分钟时也相对稳定。因此，可在65℃～100℃的温度下加热、沉淀以除去胞溶质中的杂质（加热至95℃制备的肝细胞生长素（HGF），其特异性比加热至65℃的要高5倍，现已将加热至95℃、15分钟作为肝细胞生长素（HGF）的常规制备步骤。），在pH2～9范围内稳定，但在pH2以下失去活性。肝细胞生长素（HGF）带有较多的负电荷。肝细胞生长素（HGF）是一种分子量小于12000小分子物质，用1%的2-硫基乙醇与1%的二硫赤藓糖醇处理后不失去活性，即表明二硫键对于活性不是必需的。用胰蛋白酶消化能使肝细胞生长素（HGF）失去活性，表明它是一种蛋白质，而神经氨酸酶不影响肝细胞生长素（HGF）的活性，又表明它不是糖蛋白。肝细胞生长素（HGF）可用酒精沉淀，用40%酒精沉淀法制备肝细胞生长素（HGF），不仅可以提高它的纯度和特异性，而且还可以从胞溶质中除去胰高糖素、胰岛素等溶于酒精的物质。肝细胞生长素（HGF）的作用具有器官特异性，只能刺激肝细胞的DNA合成，促使肝细胞的再生;改善枯否氏细胞吞噬功能，防止肠道内毒素对肝细胞的损害;刺激胰岛素分泌，促使与肝细胞结合增加，利于肝细胞的修复;大量的支链氨基酸的存在，促使肝昏迷后的苏醒;多量的微量元素锌，促进免疫功能;β-葡萄糖醛酸酶的增加稳定溶酶体膜的功能，而对脾、肾和骨髓等的细胞则无作用。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：采用负压透析法制备肝细胞生长素（HGF）的方法的特征是：

a.采集幼龄健康动物的新鲜肝脏（离体6小时内），除去肝膜及韧带后切碎;