[发明专利]纯化与结晶两性霉素B的方法

说明书

本发明涉及一种用于纯化与结晶两性霉素B的方法及组合物。

两性霉素B，一种有效的抗真菌剂，是一类已知多烯大环内酯抗菌素化合物中的一员。这些化合物的特征为有一个大的内酯环，该环含有一条共轭双键链。

两性霉素B及其由结节链霉菌Streptomyces    nodosus制备的方法已被Dutcher等人在1959年10月13日批准的2，908，611号美国专利中公开。两性霉素B的结构已知为

由Dutcher等人公开的两性霉素的提取与结晶方法包括：

a.在带有一种酸的乙醇中将两性霉素的粗制品调成浆，然后用强碱中和;或

b.用二甲基甲酰胺将两性霉素粗制品调成浆，并用醇的水溶液或酮的水溶液处理。

michel等人在4，177，265号美国专利中公开了利用一种增溶介质纯化两性霉素B的方法，该介质含有碘化钠或硫氰酸钠以及丙酮或甲醇。使用这些介质中的任何一种可以大大增进两性霉素B的溶解度，而两性霉素B在丙酮或甲醇中的溶解度是受限的。

已经发现了用于纯化两性霉素B的新的方法和组合物，获得稳定产率的，高度结晶的产品。

根据本发明，公开了一种新的适于纯化两性霉素B的可获得稳定高产率的结晶物质的方法与结晶组合物。这种新的两性霉素B组合物含有溶于甲醇、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和水的溶液中的两性霉素B。这种新的方法包括将粗制的、部分纯的或含杂质的两性霉素B溶于甲醇、二甲基甲酰胺和一种酸的溶液中，从提取混合物中分离出不溶成分，将纯的提取物与二氯甲烷和水的混合溶剂合并，使两性霉素B结晶，并回收结晶产物。

已经发现通过使用本方法的四溶剂系统，可以大大改进制备两性霉素B方法的连贯性以及产物的结晶性质。这种四溶剂系统包括最初溶解两性霉素B的二甲基甲酰胺和甲醇，以及将初始溶液过滤后所加入的二氯甲烷和水。所得到的两性霉素B结晶组合物含有溶于这四种溶剂中的两性霉素B和一种可与两性霉素B形成盐的酸。此外还发现当纯化、结晶、过滤、洗涤后，如果将产物干燥到使其保持至少2%（重量）的水、最好是约2-6%（重量）的水，可以获得更稳定的结晶物质。

下表说明了本发明方法的优点。表中所示为按照Dutcher等人在2，908，611号美国专利中描述的方法制备的两性霉素B与按照本发明方法制备的两性霉素B的比较。对各个产品的微生物效能、产率、纯度（通过产物灼烧后的残渣测量）以及稳定性进行测量。

微生物效能    产率    纯度    稳定性

（灼烧    （活性损失

残渣）    /年）5℃

先有技术方法    884mcg/mg    80%    2.5%    10-15%

（重量）

本发明方法    1000mcg/mg    97%    ＜0.1%    ＜5%

（重量）

虽然还不知道发生这些改善的准确机制，但是可以确信，加至两性霉素B、甲醇和二甲基甲酰胺中的二氯甲烷和水增强了结晶结构，并因此增加了所生成的两性霉素B的微生物活性、纯度以及稳定性。

在该纯化方法中用作起始物质的两性霉素B可以包括粗制的、部分纯化的或含有杂质的两性霉素B。所谓“含有杂质的两性霉素B”是指含有物理杂质，例如杂污物颗粒、纤维状物质及其它可导致两性霉素B不适于药用的颗粒成份。

本方法中，第一步是通过将两性霉素B按任何次序悬浮于甲醇和二甲基甲酰胺的混合物中，并向其中加入酸，以提取两性霉素B起始物质。这种酸可以是任何容易与两性霉素B形成盐的酸，如柠檬酸、盐酸、硫酸等。温度不是关键的，但是最好是调节这样形成的混合物的温度到大约15-20℃下进行萃取，并搅拌直至两性霉素B的起始物质溶解。

应用本技术领域众所周知的方法分离该提取混合物。最好是使用过滤的方法将不溶物与两性霉素B提取物分离。

然后将纯化的两性霉素B提取物与二氯甲烷和水的混合溶剂合并。温度与加入二氯甲烷和水的顺序不是关键的，当然最好是将水冷却至约5-10℃。用一种碱的水溶液，例如三乙醇胺水溶液或任何其它合适的碱将混合物的pH值调至大约5-7，最好是约为6。该混合物沉淀出非晶形产物，并且所获得的这种浆料（非晶形产物和溶剂的）提供了一个合适的环境，促使两性霉素B转化成为结晶物质。

通过在约40℃-60℃、最好是在约45℃至约55℃加热，这种非晶形两性霉素B的浆料转变成为结晶物质。不是必要的，也可以向此浆料中加入少量晶种以加速结晶。