[发明专利]一种新的免疫诊断方法

说明书

猪囊尾蚴即猪肉绦虫的幼虫形式，其可感染人脑引起严重的神经系统症状，即所说的神经囊尾蚴病（NCC）。根据囊泡在颅内的定位，可常见有下列临床表现。

定位    临床症状    后遗症

脑实质    癫痫

占位性损伤（SOL）    运动或感觉缺陷

精神病

大脑炎

脑膜    慢性脑膜炎    脑积水

脑神经瘫

运动和感觉缺陷

脑室    SOL    脑积水

这里描述的所有临床症状可由许多致病因素引起，神经囊尾蚴病的常规鉴别诊断是神经系统的结核分支杆菌感染。这种疾病的诊断是基于对头颅的放射学检查。颅内死亡的钙化囊泡在X光下显示为致密的射线不透过性损伤，而活囊泡在计算机控制的断层扫描图（CAT-SCAN）上则呈现为低密度或高密度损伤。近年已使用中枢神经系统的磁谐振图象技术观察活的囊泡。能否通过这些影象鉴定出囊泡，主要取决于囊泡的大小及周围宿主组织的反应情况。但在流行这种疾病的许多发展中国家，大多不容易得到这种图象装置，而迫切需要建立一种更为简单的诊断方法。因此，要求有一种能够将神经囊尾蚴病与其他神经病鉴别开的免疫诊断试验法。已有的免疫学试验大多都是基于检测抗特定生物体原之抗体的。此外，许多试验都是作为流行病学调查的手段而建立的血清诊断试验，而且已有这些试验均不适于用作神经囊尾蚴病的特异性诊断方法。

试验的特异性和敏感性主要取决于试验中使用的抗原。本发明描述了一种制备能提高免疫诊断之特异性和敏感性的猪囊尾蚴抗原的方法。

可作为囊泡的总匀浆液（1），或囊泡固体部分即泡壁与头节或单纯泡壁的匀浆液（2）来制备猪肉绦虫幼虫的粗提物。某些情况下，也可用囊泡作为抗原（3）。该匀浆液通常要以15，000-20，000g离心15至30分钟，以除去细胞碎片和核等。用丙酮提取匀浆液除去大部分脂类，并用于补体结合试验（4）。这些粗提物和总抗原可用于许多免疫检测法中，如被动血凝试验（5、3）、免疫电泳（1）和酶联免疫吸收试验〔（ELISA）（1，6和7）〕。

Kuhn等人（8）描述了使用囊泡的总匀浆液所作的ELISA试验，并将试验的敏感性归因于一组蛋白质抗原。这些抗原未经纯化，也没有试验它们的特异性。总匀浆液除含有可看到的并经Western印迹法鉴定为免疫性材料的蛋白质外，还含有脂类及碳水化合物。其中没有证实非蛋白质抗原浓度对ELISA之总体敏感性的影响。虽然在ELISA试验中使用了表现有纤维结合素性质的单一抗原（抗原B），但其敏感性不能令人满意（9）。

在免疫诊断中，使用寄生虫的总匀浆液作为抗原有几个方面的缺点;（ⅰ）它含有几个能与其他CNS病原体发生免疫学交叉反应的抗原决定基;（ⅱ）已证明几种寄生蠕虫共有交叉反应性抗原（10）。在发展中国家如印度、墨西哥、巴西、中国、泰国及中非和亚洲国家，人群中寄生虫感染是很普遍的，许多人体内都携带抗这种交叉反应性抗原的血清抗体。当这些人感染了能打破血脑屏障的疾病时，血清抗体即可进入脑脊髓液（CSF）中，干扰囊尾蚴病的诊断，导致假阳性结果。

考虑到总匀浆液缺乏特异性，而试图鉴定并纯化种和组织特异性抗原，即得自头节和囊泡液的抗原。作为猪肉绦虫种特异性抗原，已鉴定了表观分子量为大约26，000和8，000的两种多肽。这些抗原在免疫印迹试验中可与得自受猪肉绦虫感染之病人的血清反应，但不与受其他蠕虫感染之病人的血清反应（11）。这些抗原的特异性或对其他相关CNS疾病的敏感性尚未被证实。已证明使用抗囊泡液总蛋白的单克隆抗体由囊泡液中纯化的抗原在免疫诊断中是很特异的，但用于检测NCC则缺乏敏感性（12）。使用单克隆抗体纯化的表观分子量约为80，000和10，000的头节特异性蛋白质，在囊尾蚴病的血清学诊断中有100%的敏感性。据称这些抗原可用于区分绦虫病和囊尾蚴病，但其在鉴别神经囊尾蚴病与其他系统性囊尾蚴病中的作用则没有得到证实（13）。

本发明人在实验室中进行的一项研究进一步说明了用总匀浆液作抗原的缺点（14），现总结如下：

制备囊泡匀浆并用超声处理（8×30秒脉冲）。将匀浆溶解于1%SDS中并于100℃下用1%β-巯基乙醇处理，然后在Sephacryl    S-300柱上进行凝胶过滤，分离成三个部分：

部分Ⅰ：分子量大于66KD的囊泡抗原

部分Ⅱ：分子量在25-66KD之间的囊泡抗原

部分Ⅲ：分子量在14-35KD之间的囊泡抗原