[发明专利]借助游离基检测活生物体或潜在攻击剂之抗氧化性的方法

说明书

本发明涉及利用游离基检验或测定活生物体或潜在攻击剂之抗氧化性的新颖方法。

具体的说，本发明一方面涉及评估活生物体细胞的抗氧化状态的方法，另一方面涉及评估潜在攻击性化学剂或物理因子（亦即能够增加或加速或抑制或延迟被游离基诱导之细胞溶解作用的化学剂或物理因子）之氧化活性或抗氧化活性的方法。

已知游离基通常对生物体，特别是对该生物体的细胞具有不良影响。游离基以一定的速率攻击细胞壁，该速率系取决于细胞的酶及分子机制所提供的细胞抗性。当细胞壁受到游离基降解，穿孔或打开时，细胞内容物即散布于细胞壁外。具体参见下列文献：化学文摘107213235V，化学文摘107，232454g，化学文摘10099345j，生物学文摘72（n°9），5914页;摘要n°57169（1981）及生物学文摘73（n°12），8817页摘要n°84420（1982）。

文摘CA107，213235V，（参见M.MIKI等人，Arch.Biochem.Biophys.，258（n°2），373-380页（1987）），指出2-生育酚可使大鼠红血球免于遭受游离基导致的溶解作用。

根据上述文摘CA100，99345j（参见E.B.SPEKTOR等人，Lab.Delo（n°1），26-28页（1984）一文），样品（血浆或脊髓液）的总抗氧化活性系利用紫外灯诱导细胞材料（本特例为红血球细胞膜）之自由基后，经检测532nm吸光率而确定的。根据本发明，推荐一种新颖技术解决方案，借此（ⅰ）游离基不会于所说的细胞材料内产生，而是来源于加入细胞材料内的游离基引发剂，及（ⅱ）细胞材料已首先污染了潜在攻击剂。

根据本发明，推荐一种检定或估测活生物体或潜在攻击剂之抗氧化活性的新颖方法，该方法包括使用游离基作为诱导细胞溶解的工具材料，该方法的特征在于：

（1）使游离基产生剂于适当液体生物学介质内与选自下列之任一种细胞材料（Ⅰ）接触

（a）人类，动物及植物细胞，

（b）所说之细胞的碎片，及

（c）含有脂质体的合成壁及其碎片，

所说的细胞材料已首先沾染了潜在攻击剂（Ⅱ）;

（2）诱使游离基从游离基产生剂中释放出来;及

（3）被游离基所溶解之细胞材料借助与含有未受污染之细胞材料之对照组的比较来估测游离基对细胞材料的溶解作用。

本方法中，检定了细胞材料Ⅰ的氧化状态或潜在攻击剂Ⅱ对细胞材料Ⅰ的影响。

具体地说，可按照“动力学”〔以固定时间间隔检测游离基产生剂、细胞材料及适当待测试剂Ⅱ之液体试验介质的样品（体积恒定）〕或以“非动力学”〔对含有细胞材料、必要时加有待测试剂Ⅱ，以及渐增等分游离基产生剂之液体试验介质的样品进行剂量-反应型检测〕方式估价细胞材料的溶解。

在进行动力学评估的情况下，细胞材料Ⅰ对游离基的抗性是以对应于50%细胞材料溶解的时间来表示的。

在进行剂量-反应评估的情况下，细胞材料Ⅰ对游离基的抗性是以可诱使50%细胞材料溶解之游离基产生剂的浓度来表示的。

可释放游离基及常用于产生大分子之聚合反应的产物均特别适于作为本发明的游离基产生剂。此类产物中，特别值得提到的是：氧化性游离基产生剂如过氧化苯甲酰，C₁-C₈且较好为C₃-C₄烷基过苯甲酸酯（特别是正丁基，叔丁基，异丙基及正丙基过苯甲酸酯），其中烷基为含有1至8个碳原子且较好为3至4个碳原子的二烷基过氧基二碳酸酯（特别是二异丙基过氧基二碳酸酯），羟基过氧化枯烯，偶氮-双（异丁腈），2，2'-偶氮-双（2，4-二甲基戊腈），2，2'-偶氮-双（2-脒基丙烷），和它们的加成盐如盐酸盐，及其类似物。

优选的氧化性游离基产生剂为具有零级动力学或反应速率者（游离基的释放相对于时间为恒定的），或较好有1级动力学或反应速率者（游离基的释放相对于时间为线性的）。根据本发明的优选氧化性游离基产生剂可以是2，2'-偶氮-双（2-脒基丙烷）二盐酸盐，其可于含水介质内呈现1级动力学;也可以是2，2'-偶氮-双（2，4-二甲基戊腈），其可于油性或有机液体介质内呈现1级动力学。从游离基产生剂中释放游离基可根据已知方法进行，例如利用热、光（特别为可见光谱的光或紫外光）、质子、电子或X-射线;此种释放最好借助质子或热来发动。例如，可将2，2'-偶氮-双（2-脒基丙烷）二盐酸盐的水溶液加热至37℃，即足以根据如下反应诱发氧化性游离基的释放