[发明专利]α-肿瘤坏死因子的反向反信使核糖核酸寡聚核苷酸序列的制备方法

权利要求书

1)制备具有式(Ⅰ)结构的α-TNF的反向反信使RNA寡聚核苷酸的方法，

   5′                 3′

(d)TCA TGG TGT CCT TTG CAG-X (Ⅰ)

   1                  18

X代表一个氢原子或全部或部分ⅠA序列：

  5′               3′

-CC TCA TGC TTT CAG TAG  (ⅠA)

19                  35

可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸型，其特征是在载体S上固定待合成的链(Ⅱ)3′位第一个核苷酸，

其中S代表载体，Z代表一个含2～20碳原子的烃基，B₁相当于第一个核苷酸的嘌呤或嘧啶碱基，其胺基功能基已被保护，R是保护基，用酸试剂将5′位羟基脱去保护基，得产物(Ⅲ)，

其中S，Z和B₁意义同上，产物(Ⅲ)与第二个核苷酸单体(Ⅳ)反应，

其中R意义同上，B₂相当于第二个核苷酸的嘌吟或嘧啶碱基，其胺基功能基已被保护，R₁代表烷基或-OR^′₁，或-SR^′₁，其中R^′₁代表一个保护基，R₂代表一个保护基，于是得产物(Ⅴ)，

其中S，R，R₁，B₁和B₂意义如上，产物(Ⅴ)经氧化后得产物(Ⅵ)，

其中S，R，R₁，B₁，B₂和Z意义如上，X₁代表一个氧或硫原子，然后如上述由产物(Ⅱ)开始的反应，将产物(Ⅵ)与一个新的核苷酸单体反应产生一个新的环，直至所需的链形成，以得到最终的产物(Ⅶ)，

其中S，R，R₁，B₁，B₂，X₁和Z意义同上，B_Z代表序列的最后一个核苷酸，然后使寡聚核苷酸脱去保护基，从载体上分离，并将得到的产物纯化，或

式(Ⅰ)所定义的寡聚核苷酸聚L-赖氨酸衍生物的制备方法，该方法的特点在于使产物(Ⅷ)与产物(Ⅳ)反应，得产物(Ⅸ)，

式(Ⅷ)中S，Z，R，B₁意义如上，

式(Ⅸ)中S，R，Z，R₁，B₁和B₂意义如上，

然后经氧化，并去除载体和活化基团，得产物(Ⅹ)，

其中R，R₁，B₁和B₂意义如上，X₁代表一个氧或硫原子，末端核糖被氧化后在还原性介质中与L-赖氨酸反应，得产物(Ⅺ)，

其中R，R₁，B₁，B₂和X₁意义如上，然后按产物(Ⅵ)起始的反应步骤继续合成。

2)权利要求1的方法，其特征在于

-产物（Ⅱ）5′位上羟基的解封采用酸性试剂，

-产物（Ⅲ）与产物（Ⅳ）的偶合反应由乙腈中的四唑活化，

-产物（Ⅴ）的亚磷酸酯由溶于水/二甲基吡啶/四氢呋喃混合液或水/吡啶/四氢呋喃混合液中的碘氧化为产物（Ⅵ）的磷酸酯，

-产物（Ⅴ）的亚磷酸酯由溶于二硫化碳、无水吡啶和无水三乙胺混合液中的硫作用氧化生成硫化型（Ⅵ），

-在合成结束时5′位上的末端羟基由酸试剂如乙酸，二氯或三氯乙酸脱去保护基，

-寡聚核苷酸（Ⅶ）脱去保护基是在温和加热反应介质下用浓氢氧化铵进行的。