[发明专利]尿激酶生产方法

说明书

本发明涉及以工业规模精制人尿而制取高纯度尿激酶的方法。更具体地讲，从含尿激酶的人尿中，以氯化锌或硫酸铜为主要成分，沉淀出尿激酶。

尿激酶为人尿中以约30-80g/l存在的一种酶，可通过血纤维蛋白溶酶原转换成活性血纤维蛋白溶酶的作用而溶解血管内的凝固血栓。数十年来，精制尿激酶一直用于治疗因血管内形成血栓而导致的心肌梗塞，脑中风等疾病。

以前，为了从人尿中提取尿激酶，第一步的高浓缩方法被认为是最重要的过程，而吸附剂则使用硫酸钡，硅胶，硼润土，沸石，羟基磷灰石，磷酸纤维素，控制孔径玻璃(CPG-10)等，大部分操作既复杂，回收率又低，溶解后的变性也大，因此在工业上的应用受到许多限制。而且，就用重金属作吸附剂的蛋白质沉淀方法而言，虽然1920年代就已有报告，但在工业上的应用都很少。最近，Zawarski为回收重组蛋白质，建议使用锌(见P.G.Zawarski and G.S.Gill，Anal.Biochem.173，440(1988))。

但是，用锌的上述方法不过是使从少量培养液中分泌出的重组蛋白质部分沉淀，因此工业上强烈要求开发一种高效尿激酶生产方法。

为了解决上述各种问题，本发明人进行了广泛的研究，结果发现，采用氯化锌或硫酸铜作沉淀剂，用适当溶液回收尿激酶后，直接进行亲和性色谱分析，即可迅速，简便，高效率地生产出尿激酶，从而完成了本发明。

本发明目的是提出高纯度精制尿激酶生产方法。

以下详述本发明。

人尿中加碱或碱性水溶液调节至pH7.5-8.0，放置后尿中大部分固体成分沉淀出来，然后滤出上层清液，为使氯化锌或硫酸铜充分溶解于其中可用盐酸等酸溶液调至pH4-6之后添加氯化锌或硫酸铜，使其浓度保持在1-2mM。此时，添加了氯化锌或硫酸铜的人尿中含有的组氨酸残基与露出的蛋白质结合，以水溶液形式存在。如用氢氧化钠水溶液将其pH调为中性，则锌离子或铜离子就会形成复合体而沉淀出来，同时也使蛋白质沉淀出来。图2和3所示，在氯化锌或硫酸铜达到1-2mM的低浓度状态下，尿激酶可选择性沉淀，相反，占人尿蛋白质80-95％的清蛋白要在10mM以上的浓度下才会沉淀，因此用氯化锌或硫酸铜进行尿激酶沉淀不仅具有浓缩效果，而且具有精制效果。使前述形成沉淀的溶液离心分离而回收沉淀物，再用高浓度EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)溶解，可使其完全溶解。此时，作为溶解使用的EDTA溶液在pH7.0-8.0之间使用，而且其体积比氯化锌或硫酸铜处理所得沉淀物大4倍，故若充分搅拌，则可达到95％以上的回收率。

最近，日本化学制品公司，丙烯腈公司等皆有约90％溶解回收率的报告(参照南朝鲜专利公告第77-49号)，但其价格高，且溶解所用强碱会使尿激酶活性发生变化。而本发明所用EDTA不仅对尿激酶活性完全没有影响，而且可使尿激酶比活性度比原尿提高约20倍，纯度则可达每mg总蛋白质100IU值。

由于以上所述沉淀和部分精制步骤只需在反应槽内进行1小时，工艺简单，而且经济，回收率和精度均很高。

上述EDTA溶液溶解的尿激酶呈水溶液状态，若放在低温下，则再沉淀出对尿激酶活性完全没有影响的尿素等固体成分。可离心分离除去沉淀物，再将上层清液小心倾倒在亲和性柱上。该亲和性柱上使用与单一抗体结合的琼脂糖(セフ_ァロ-ズ)及联苯胺结合的琼脂糖。在精制程度和回收率方面考虑，用琼脂糖效果好，工业处理100001以上人尿时，应用单一抗体的免疫亲和性柱要受到各种限制，如用于工业生产规模时，必须用数十克单一抗体，从技术和成本上讲均不理想，而且即使单一抗体在载体上固化，也会再度混入分离后的制品中的缺点等，由于不方便，所以特别希望用联苯胺-琼脂糖亲和性柱色谱法完成最终精制过程。

据报告，除了尿激酶以外，联苯胺-琼脂糖还对数种丝氨酸蛋白酶(セリンフロテア-ゼ)具有亲和性，而在本发明中，已发现可通过调节氯化锌或硫酸铜的浓度，而选择性地分离这些丝氨酸蛋白酶。

通过上述用联苯胺-琼脂糖进行的精制过程，可使尿激酶的比活性度高达每mg总蛋白质约123000IU，可得到分子量大部分为53000的高纯度尿激酶。这里，比活性度的测定可用公知的尿激酶活性测定法(参照Astrupetal.Arch.Biochem.Biophys.40，346(1952))，其中由定量测定所得蛋白质量而得比活性度(参照Bradford(1976)Anal.Biochem.72，248)。

以下举例详述本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。