[发明专利]大鼠促黄体生成素和催乳素的四氯二苯脲标记法

说明书

本发明涉及一种测定大白鼠垂体分泌的促黄体生成素(rLH)和催乳素(rPRL)的标记方法。

在生殖生理和计划生育科研中，经常需要测定大白鼠垂体分泌的促黄体生成素(rLH)和催乳素(rPRL)，放射免疫测定的关键环节之一是标记抗原的制备，它要求标记物具有高纯度、高比活度，并且保持良好的免疫活性和稳定性。在国内尚未见报道rLH和rPRL的标记方法，国外对人生长激素等多肽激素的标记从60年代开始见诸报道，但多采用氯胺-T(chloramine-T)法，这种方法，存在一些缺点，如需要较大剂量的碘化钠(Na¹²⁹I)和氯胺T，需要加还原剂，标记率较低等。

本发明的目的是提供一种用碘量小，标记率高，不需要加还原剂，可获得免疫活性高，稳定性好的标记抗原大白鼠促黄体生成素(rLH)和催乳素(rPRL)的四氯二苯脲(Iodogen)标记法。

为此，本发明rLH和rPRL的Iodogen标记法如下所述：先将氧化剂四氯二苯脲(Iodogen)溶于二氯甲烷中，浓度为0.4-0.5毫克/毫升，取其中40-60微升置于具盖反应管中，在15-20℃室温下干燥使溶剂挥发干，这样，可使氧化剂在反应管底部形成均匀的薄膜，标记用促黄体生成素(rLH)或催乳素(rPRL)10-20微克溶液，8-12微升及0.5M、PH7.2-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)90-110微升，分别置于上述的具盖反应管中，然后加入0.4-0.6毫居里的碘化钠溶液，连续搅拌7-10分钟，此时即把Na¹²⁹碘标记到了激素酪氨酸残基的羟基上，最后加入150-250微升、0.05M、PH7.2-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)静置4-6分钟后上柱。以30×1.0厘米葡聚糖G100层析柱分离纯化，0.05M、PH7.2-7.6的PBS平衡并洗脱柱子，用自动收集器收集洗脱液，流速1毫升/2分钟/管，共收集30-40管，然后依次测定各管的放射性，标记产品(¹²⁹I-rLH或¹²⁹I-rPRL)为大分子物质，通过凝胶间隙向下速度较快，首先被淋洗下来，即在第9-11管出现标记激素峰，而小分子的无机碘在第19-21管出现，即游离峰。标记激素(产品)以0.1M、PH7.2-7.6含有0.4-0.6克/100毫升溶液的牛血清白蛋白和0.1-0.3克/100毫升溶液的迭氮钠的PBS稀释一倍，存在2-5℃温度下存放备用。

经试验证实，本方法标记率达80％，放射化学纯度在90％以上，最大抗体结合在80％以上，而非特异性结合较低，为3％，贮存8周期而无明显变化，适于放射免疫分析或放射受体测定。

本发明采用Iodogen方法标记大鼠rLH和rPRL，获得了纯度和比活度均较高的产品，而且激素蛋白免疫活性损伤小，较为稳定，重复性好。此外，本方法用碘量小、标记率高，不需要加还原剂，就可获得免疫活性高，稳定性好的标记抗原。

实施例：

将Iodogen溶于二氯甲烷中，浓度为0.5毫克/毫升，取其中50微升置于3.6×1.2厘米的具盖聚丙烯管中，在20℃温度使溶液挥发干。标记用rLH或rPRL15微克溶液10微升及0.5M、PH7.4的PBS100微升，分别置于上述的聚丙烯管中，然后加入0.5毫居里的碘化钠溶液，连续搅拌8分钟，最后加入200微升、0.05M、PH7.4的PBS静置5分钟后上柱，以30×1.0厘米葡聚糖G100层析柱分离，0.05M、PH7.4的PBS平衡，采用BS-100A自动收集器收集洗脱液，以1毫升/2分钟/管的流速收集30管，然后依次测定各管的放射性。