[发明专利]生产转基因玉米的方法

说明书

本发明涉及可繁殖的转基因的玉米(Zea mays)种的植物(本文常称为玉米或谷类)，进一步说，本发明涉及通过颗粒轰击和随后的筛选技术来生产可繁殖的转基因植物。

植物的基因工程包括遗传物质(通常是指DNA或RNA形式)的分离和加工处理然后将这些遗传物质引入植物或植物细胞，它为农业和植物育种的现代化提供了可靠的保证。借助于遗传工程技术，可望实现提高作物的食用价值、更高产量和饲养价值，降低生产成本，增强作物抗虫害、抗旱能力和增强耐受力，并可生产药用成分、化学物质和生物分子以及其它优良品质。一旦某种基因被鉴定、克隆和加工处理，还必须以某种方式引入到一种有益的植物中，结果得到的植物既能繁殖，且还能将引入的基因遗传给子代。

目前已建立了许多方法，利用这些方法可将DNA转化各种植物和植物细胞。一般说来，这些植物都是双子叶的，但也有某种单子叶谷类转化成功的极道。然而，已证实某些植物种类至今还不能通过任何方法进行转化。因此，在本文的发现以前未能建立任何方法生产稳定转化的玉米(Zea mays)植物，在此植物中导入的重组DNA至少通过一个完整的生殖周期进行遗传。这些不成功的技术已在文献中有详细记载，并且最近有大量的评论文章对此进行讨论。(I.potrykus，Trends in Biotechnology，7,269，(1989)；K.Weising et al.，Ann.Rev.of Genetics，22,421，(1988)；F.Cockinget al.，Science，236，1259，(1987))。

已经尝试或提出了一些将DNA导入谷类细胞中的方法，包括电穿孔、微注射、微射弹轰击、脂质体融合、农杆菌介导的转移、宏观注射和暴露于裸露的DNA溶液中。

例如，J.Dewet et al.，Experimental Manipulation ofOvule Tissue，G.Chapman et al.，eds.，Longman，Inc.，New York(1985)P.197-269和Y.Ohta，PNAS USA，83,715(1986)都曾报道过将花粉粒与DNA溶液混合后将花粉撒到玉米须上，从而将DNA导入玉米中。在这些文章中，没有分子水平的数据来证实外源性DNA引入谷类细胞中。Arntzen等人在欧洲公开专利申请No.275,069中描述过将DNA与玉米花粉一起培育，然后给玉米穗授粉，并形成种子。已有报道，从这些种子长成的植物含有引入的DNA，但这不能说明导入的DNA可以通过一个完整的生殖周期进行遗传。

A.Graves等人(Plant Mol.Biol.，3，43(1986))报道了农杆菌介导的玉米幼苗的转化。所得证据是基于有时不可靠的分析。至今还没有关于用花粉和农杆菌介导的转移技术成功的进一步报道。

已有报道用微射弹轰击技术生产转化的玉米细胞，该技术是Sanford等人描述于Part.Sci.& Techn..5.27(1987).也见J.C.Sanford et al的欧洲公开专利申请No.331,855，该专利是基于在美国1988年2月29号申请的，申请号为07/161,807的专利。Klein等人在Plant Physiol.，91，440，(1989)也曾描述用微射弹轰击技术转化玉米细胞，但所用细胞不能够再生成为植物。因此，还未有公开方案描述过用轰击技术将DNA导入任何类型的具再生能力的玉米细胞培养物中。也没有报道过，通过轰击玉米愈伤组织，随后再生可育的玉米植株，且至少通过一个繁殖周期传递引入的基因而导致一种引入的基因稳定。D.McCabe等人在欧洲公开专利申请No.270,356中公开了用DNA轰击玉米花粉、花粉授到玉米须上且产生种子，据报道种子含有外源性DNA，但没有证据证明导入的DNA在一个完整的生殖周期中进行了传递，且这些人也没有进一步报道结果。

M.E.Fromm等人报道了用玉米原生质体的电穿孔而使DNA转化细胞(Nature，319，719(1986))，但这些转化细胞没有提供再生植物。C.Rhodes等人也报道过玉米原生质体的电穿孔(Science，240，204，(1988))。尽管能转化受体细胞，而且后一种情况，能再生植物，但植物本身是不育的。此外，Rhodes所用的生产细胞系的方法不具有重现性。