[发明专利]用链霉菌制备外源蛋白的方法

说明书

由欧洲专利的公开号为(EP-A)0289936可知，制备融合蛋白质的方法，是将欲得到的蛋白质的结构基因偶联到按需要交换了的tendamistat基因密码链的3′一末端上，这个结构基因在宿主细胞链霉菌上得到表达，分泌出的融合蛋白质自细胞中分离出，一种优选的实施形式是于3′-末端缩短tendamistat基因，为此，限制性内切酶BstEII的酶切位点在三联体31和32处，Stui在三联体的43和44处，Sau3A在三联体的52和53处。

本发明思想的进一步发展，是提出了制备融合蛋白质的方法，此时，被缩短的前胰岛素跟随串联部分，它的C-链只是由一个或两个赖氨酸残基组成(“小型前胰岛素”)。再进一步发展，提出了在该融合蛋白中，串联部分也被缩短了(见1990年5月9日公开的EP-A-0367163)。

现在却意外地发现，在链霉菌中具有非常短的tendamistat部分的融合蛋白质是很稳定的，并且可从培养基中分离出，由于非常短的tendamistat链，这样得到的融合蛋白有“成熟蛋白”的特点，并且在培养基中通常以富三级结构的形式存在。

EP-A0177827报道了表达系统中为使蛋白质运载的合成密码顺序，其特征是，该DNA基本上相当于天然的密码顺序，但核酸内切酶的或多或少的酶切位置表明，它并不含于天然DNA中，若将负责运载蛋白的基因偶联到某个DNSA序列中，这个融合基因在一载体上建成，因而宿主细胞发生转化，将外引物蛋白(ex-primierteProtein)自细胞浆中转运出。因此，可在原核生物细胞和真核生物细胞中制备真核生物、原核生物或病毒蛋白。作为实例的胞浆外蛋白碱性磷酸酶表明，在大肠杆菌的表达中，下面是有利的：在连结原顺序时，碱性磷酸酶的大约前40个氨基酸的密码要置于所需蛋白质的结构基因之前。在多数情况下，要补充少许氨基酸，例如大约10个，最合适是大约5个。具有猿原胰岛素的相应的融合蛋白大约有90％转运到胞浆外周空空。

在WO 91/03550(1991年3月21日公开)也提到了制备融合蛋白质的方法，即组建混合型的寡核苷酸，它构成融合蛋白的压载(Ballast)部分的密码，这些寡核苷酸插接在这样的区段，以便使它偶联在起调控功能的部位和所需蛋白结构基因上。由此得到的质粒宜于宿主细胞的转化，并选择出编码有高产率的融合蛋白的克隆，寡核苷酸以4-12个三联体组成为好，尤以4-8个三联体最好。

已试图制备具有短压载部分的融合蛋白，例如制备了这样的融合基因，这种为制备融合蛋白的基因有β-半乳糖苷酶的前10个氨基酸及生长因子释放抑制因子的密码。然而实验表明，为了保护融合蛋白免受宿主细胞中特异的蛋白酶的破坏，这样短的β-半乳糖苷酶的片段是不够的(US-A4366246，第15栏，第2段)，而相应于欧洲专利EP-A-0290005和0292763报导的融合蛋白的压载片段却有多于250个氨基酸组成。

但是融合蛋白是tendamistat基因的大约前10个氨基端的氨基酸和所需的蛋白质(例如前胰岛素)时，在链霉菌宿主细胞中却出人意料地稳定并分泌到介质中，由介质中可以得到高产率的融合蛋白，这也意外地适用于较小的蛋白质如“小型胰岛素原”。

此外“大约10个氨基酸”表明，也涉及较少的氨基酸，例如ten-damistat的只有7个N-端氨基酸，但最好不超过10个。优选的融合蛋白是它的tendamistat部分的7位和/或9位为脯氨酸(如天然顺序那样)。但是，按照已知的或预定的结构类型选择较大的ten-damistat-压载部分显然也是可能的，不过徽小的“压载部分”的优点自然会越来越丧失掉。

改变tendamistat部分的天然氨基酸次序。交换或删去某些氨基酸，或者插入在天然氨基酸顺序中不存在的氨基酸是可以的甚至是有利的。

本发明思想的特别有利的融合技术，可以通过简单的预试验得到了解。

另外，还可以用其它革兰氏阳性细菌来实现本发明思想，例如用杆菌或葡萄球菌细胞，使用这些缩主已知的信息顺序列。

按照本发明得到的融合蛋白以溶解的形式存在于培养基，这对进一步处理和精制有许多优点。例如用酶法进一步直接处理分泌产物以裂解掉压载部分，否则必须进行处理步骤，如同对不溶性的融合蛋白质所必须处理的那样。在进一步处理之前可以进行浓缩或纯制，例如用亲和色谱，超过滤，沉淀，离子交换色谱，吸附色谱，凝胶过滤或高压液相色谱。

如下的实施例是对本发明作进一步说明。