[发明专利]水蛭素的重组体制备方法

说明书

本发明涉及水蛭素，其最初从药用水蛭（Hirudo  medibin  alis）中分离，以及其衍生物的制备。

最常用的抗凝血肽可能属于水蛭素类。水蛭素最初从药用水蛭中分离，药用水蛭（Hirudo medicinalis）为众所周知的，代表性的凝血酶多肽抑制剂¹，²，具体说，其通过离子间作用结合凝血酶而防止了纤维蛋白原断裂成为纤维蛋白形成纤维蛋白块。动物试验证实了水蛭素的预防静脉血栓形成，血管分路闭塞及凝血酶诱导的弥漫性血管内凝血（DIC）的作用。另外，水蛭素具有低毒性，很少或无抗原性并且在血液中清除的时间很短。

已知有三种水蛭素的天然变种，被称作HVI的第一个变种的序列由Dodt等人测定（FEBS  165（1984）180-184根据三联密码（Eur.J.Biochem.138，9-37，1984）HVI的序列为：

（ 缬-缬-酪-苏-天冬-半胱-苏-谷-丝-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-丝-天冬酰胺-缬-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-赖-半胱-异亮-亮-甘-丝-天冬-甘-谷-赖-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-缬-苏-甘-谷-甘-脯-谷氨酰胺-丝-组-天冬酰胺-天冬-甘-天冬-苯丙-谷-谷-异亮-脯-谷-谷-酪-亮-谷氨酰胺。

被称作HV2的第二个变种由Dodt等人叙述，（Biol.Chem.Hoppe-Seyler  367（1986）803-811）HV2在下列方面与HVl不同：异亮氨酸取代1位的缬氨酸，苏氨酸取代2位缬氨酸、赖氨酸取代24位的谷氨酰胺，天冬酰胺取代33位的天冬氨酸、赖氨酸取代35位的谷氨酸，甘氨酸取代36位的赖氨酸，天冬酰胺取代47位的赖氨酸，谷氨酸取代49位的谷氨酰胺，天冬酰胺取代53位的天冬氨酸。

被称作HV3的第三个变种被Harvey等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）1084-1088中叙述。HV3从1-32位与HV2相同。但在下列方面与HV1不同：谷氨酰胺代替33位天冬氨酸，赖氨酸代替35位的谷氨酸，天冬氨酸代替36位的赖氨酸，谷氨酸胺代替53位的天冬氨酸，脯氨酸代替58位的谷氨酸，天冬氨酸代替62位的谷氨酸，丙氨酸代替63位的酪氨酸（SO₃H），天冬氨酸代替64位的亮氨酸，谷氨酸代替65位的谷氨酰胺。

现在发明了制备水蛭素及水蛭素样多肽的新方法，该方法首先根据编码水蛭素或水蛭素样多肽的核苷酸序列进行化学合成，再用重组生物体表达水蛭素或水蛭素样多肽，遗传修饰了的生物体的培养可生成所需的具有全部生物活性的产物。

同时，本发明提供了含有编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列的表达载体。本发明还提供了与适当的表达载体转换的宿主，还提供了编码水蛭素或水蛭素样多肽的合成DNA。编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA片段可以是单股或双股的。

水蛭素或水蛭素样多肽可在其中表达的宿主中通过与本发明的适当的表达载体转换进行制备，表达载体通常的制备程序是：

（a）化学合成编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA;

（b）将该DNA插入表达载体中。

通过本发明提供的转换的宿主，并在一定的条件下使水蛭素或水蛭素样多肽于其中表达，从而制备了水蛭素或水蛭素样多肽，分离出水蛭素或水蛭素样多肽，从而得到纯化的水蛭素或水蛭素样多肽。

本文所称的“水蛭素或水蛭素样多肽”指天然形式的水蛭素HV1，HV2和HV3及其衍生物，例如，通过氨基酸取代、缺失、插入、延伸、官能作用和化学修饰得到的。本发明还可用于具有抗凝活性的HV1，HV2或HV3的衍生物。

氨基酸序列HV1，HV2或HV3可被一或多个氨基酸取代，插入和/或缺失和/或在一端或另一端延伸进行修饰，含有该被修饰序列的衍生物必须仍具有抗凝活性。HV1，HV2或HV3的氨基酸序列与其衍生物的氨基酸序列之间同源程度一般为75%或更多，同源程度也可以是85%或更多，95%或更多。

例如，HV1，HV2或HV3序列的一或多个氨基酸残基可被被取代或缺失或插入一或多个氨基酸残基，原序列的物化特性可被保留。如：电荷密度，亲脂/亲水性，大小和构型。根据单字母密码，竞争取代基为：

A代替G或相反;

V被A，L或G取代;

K被R取代;

S被T取代或相反;

E代替D或相反;

Q被N取代或相反