[发明专利]微生物杀虫剂的制造方法

说明书

本发明涉及含有苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的毒素蛋白的微生物杀虫剂的制造方法。

苏云金杆菌是在革兰氏阳性的土壤细菌中，在胞子形成期产生被称作6-内毒素的毒素蛋白。由于昆虫类，尤其是鳞翅目幼虫摄取该蛋白就会死亡，因此制造含有苏云金杆菌菌体制剂(BT剂)的杀虫剂、BT剂作为农药。1965年由美国环境保护局(EFA)所承认，并许可市售，而在日本也由几家公司出售BT剂。BT剂以及它的制法，例如，在美国专利第3071519号及第3086922号中已被揭示。BT剂，正如这些专利中公开那样，通常，培养苏云金杆菌液体，通过自然沉降，离心分离等的手段采集菌体，然后将其进行干燥，与适当的赋形剂混合的方法得到。其中毒素蛋白是如下面叙述那样，存在于苏云金杆菌的菌体内，而且通过菌的分裂等方式以向菌体外溶出的状态存在。但是使毒素蛋白沉降，需长时间，或者，如果进行离心分离，含毒素蛋白的菌体成为颗粒状，而为了取出它则需要许多劳动和动力。

BT剂与化学杀虫剂比较，对于标的害虫显示了选择性的杀虫效果，以及对环境的安全性高，因此，被认为适合于农作物或森林的树木的防虫及除虫，因而希望开发有效地制造BT剂的方法。

本发明解决了上述过去的课题，其目的在于，提供有效果地制造含有苏云金杆菌的毒素蛋白的微生物杀虫剂的方法。本发明的另一个目的是提供包括有效果地培养上述苏云金杆菌，和/或从含毒素蛋白的培养液，通过简单的操作回收毒素蛋白并制剂化的上述微生物杀虫剂的有效果的制造方法。

本发明的微生物杀虫剂的制造方法是包括将苏云金杆菌在培养基中进行培养，使培养液的毒素蛋白沉降，并将含有该沉降了的毒素蛋白的培养液进行干燥的微生物杀虫剂的制造方法，该方法还包括下面的(a)、(b)以及(c)的工程中的至少一个工程：

(a)在含有猪肉粉末作为至少一种氮源的培养基中进行培养的工程；

(b)调节该菌的培养结束后的培养液的PH值至2-4，并将毒素蛋白进行沉降的工程，以及，(c)分取含有该毒素蛋白的培养液下层，并向其中添加二氧化硅粉末，将所得的混合物进行喷雾干燥的工程。

下面，按工程顺序说明本发明的微生物杀虫剂的制造方法。

(1)菌体的培养

本发明中使用的菌是只要产生对昆虫有害的毒素蛋白的苏云金杆菌的菌株都可以用。这些例子有在特公昭58-23365号公报中记载的苏云金杆菌alesti P15A-1(微工研菌寄存号第2458号)，以及该公报中记载的苏云金杆菌aizawai 14511(微工研菌寄存号第2459号)。另外，可以使用在美国典型培养物保藏中心中被寄存的苏云金杆菌，苏云金杆菌subsp.israelensis以及苏云金杆菌subsp kurstaki的各菌株。例如，可以用ATCC No，10792，13366，13367，19265，19266，19267，19268，19269，19270，29730，33740，39756，35646，39152，33679，33680，33681，35866的菌株。

上述苏云杆菌的培养是用含有碳源，氮源，各种盐类等通常的培养基，在好气性条件下进行。例如，在含有马铃薯淀粉，酪蛋白，大豆糠，玉米淀粉，酵母浸液，磷酸三铵等液体培养基中进行预培养，然后，在含有马铃薯淀粉、猪肉粉末，玉米淀粉等的液体培养基中进行原培养。在本发明中，如上所述，作为氮源的主要成分以含有猪肉粉末为好。基中所说的“猪肉粉末”是指猪肉的干燥粉末以外，包含猪肉的萃取浸液，猪肉的酵母分解物等猪肉的成分。特别是在原培养中通过用含有猪肉粉末的培养基，可以促进δ-内毒素(毒素蛋白)的产生。猪肉粉末量，以培养基成分之总重量的10重量％以下，较好的是2-10重量％的比例来使用。培养基的PH值为6.7-7.3，通常的PH值为7左右，而培养温度为26-30℃，通常是在28℃左右进行。通常，在上述条件下进行预培养16小时左右，然后将其作为种菌，接种子原培养的培养基中，并在通气搅拌条件下进行48小时左右的培养。

(2)培养液的PH调整以及菌体的分高

在培养结束后的培养液中，添加适当的酸，例如硫酸、盐酸、醋酸等，并将该培养液的PH值调整至2-4，较好的是调整至3左右，以迅速地沉降毒素蛋白。并且由此可以防止杂菌的繁殖。