[发明专利]减少扩增过程中载带污染的方法

说明书

诊断分析通常用来检测取自病人或其他主体的测试试样中存在的分析物和/或该分析物的量。典型的分析物包括抗原及抗体，它们可用免疫诊断技术进行测定，以鉴别某些疾病状态及各种类型的非疾病状态如妊娠。在大多数诊断分析中，达到高度敏感性及特异性是尤为重要的，这一点在所需的分析物以较低浓度存在时尤为重要。能使免疫诊断过程获得较高敏感性的各种改进方案，包括：在分析程序中使用单克隆抗体以及采用在这些分析过程中引入作为标志物的扩增信号的方法。

最近，分子生物学领域内的进展使得人们可以用一种称为探针诊断法的已知技术检测测试试样中特定的核酸序列。在探针诊断方法中，通过利用一个核酸序列与试样中它的互补核酸靶分析物进行特异性结合而探测该试样。这种技术使人们可以检测早期的病症，因为该核酸遗传物质常常在用于使该核酸靶转译成抗原的足够长时间之前数月，甚至数年就出现在测试试样中，这一点在某些性传递性疾病，如人体免疫缺陷病毒感染中尤为确实。Ranki等人，The  Lancet，85（59）589-593（1987），除了检测各种疾病及遗传性失调症之外，利用探针诊断术也可以鉴别某些特定基因的存在以获得其它有关的遗传信息，如存在的编码负责移植排斥的抗原的基因，以及用于肿瘤及致癌基因检测和法医学中的遗传信息。

就其全部潜力而言，从理论上说，探针诊断可检测测试试样中小到一个分子的分子，阻止探针诊断术发挥其全部潜力的一个主要障碍是在检测测试试样中存在的通常为极微量的靶序列时所遇到的固有的困难。因此，为了提高探针诊断术的敏感度，最近人们一直围绕扩增靶核酸序列的方法而进行艰难尝试。靶序列的扩增过程可以利用许多种方法之一实现，这些方法包括将给定的DNA或RNA靶核酸序列重复再生或复制，根据所用的特定方法，使之呈线性或指数倍数扩增。

常用于制备多个拷贝数的核酸序列的早期方法包括将靶核酸序列克隆到合适的宿主细胞系统中。这些方法使用传统的克隆方法，其中将所需的核酸插入到一种合适的载体中，然后用该载体转化宿主。当该宿主经过培养生长时，载体得到复制，从而产生了所需要的核酸序列的其余拷贝。插入到载体中的靶核酸序列可以是自然存在的也可以是人工合成的。换句话说，可以在体外合成所需要的靶核酸序列，然后插入到可以通过生长而扩增的载体中，如美国专利No.4，293，652所述。

美国专利No.4，683，195和4，683，202中公开了一种通常称之为聚合酶链反应（PCR）的自动化方法，该方法可用于扩增测试试样中靶核酸序列的数量。PCR扩增过程采用两种寡聚核苷酸引物，这两种引物与靶序列片段的相对链的末端的不同部分相互补。在这些引物与靶杂交以后，在DNA聚合酶和过量三磷酸核苷存在下形成与靶序列互补的延伸产物，这些引物的定向应使由聚合酶进行的DNA合成在位于引物之间区域的对面进行且从头至尾经过该区域。然后将杂交后的延伸产物从靶中变性并重复此循环过程，在后面的扩增循环中延伸产物也可作为形成其余延伸产物的模板，连续循环扩增，直到产生足够量的靶核酸序列，从而可以在所选择的测定方法中获得可检测的信号。每一次成功的循环理论上将使前次循环所合成的核酸量增加一倍，结果使扩增产物呈指数增长。

国际专利申请No.89/02649描述了一种不同类型的自动化扩增方法。在这种类型的扩增过程中，预先合成的扩增探针对相连接杂交到一段靶序列上。然后将接触端连接，从而形成互补的扩增产物。连接之后，通过加热变性将产生的扩增产物与靶分离。用此靶和以产生的扩增产物作为后面循环过程的探针的模板而重复上述步骤，直到有足够量的靶核酸序列产生，而使在所选择的分析过程中获得可检测的信号。与用PCR法一样，每一次成功的循环理论上将使前一循环产生的核酸量增加一倍。通常将使用了预合成探针的扩增方法称为连接酶链反应（LCR）法，尽管可用不同于连接酶作用的其它方法，如化学或光化学连接使这些探针接合。

通过能对测试试样中极少量的核酸序列进行检测，核酸扩增法已彻底改革了探针诊断术，但它们在常规的诊断分析中也产生了它们自身的问题，即由于载带污染而产生一种假阳性，核酸分析物重复扩增至其在测试试样中正常浓度的数百万倍或数十亿倍，这将提高来自含有已扩增靶的新试样发生载带污染的可能性。换言之，这将在以后的测试试样中人为地产生强信号，包括阴性试样受污染时呈现假阳性。