[发明专利]粒细胞菌落刺激因子的突变蛋白

说明书

本发明涉及在含174氨基酸的成熟粒细胞刺激因子G-CSF的50到56位点上在序列50  51  52  53  54  55  56

Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile中或在含177氨基酸的成熟G-CSF-的53到59位点上或/和在含174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156和170位点上或在含177氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位点上的至少4个His残基中的一个发生突变的粒细胞刺激因子G-CSF的突变蛋白。

淋巴因子与血细胞的成熟有关。它们刺激骨髓干细胞成熟成为完全分化细胞。G-CSF是由活化的单核白细胞、巨噬细胞及一系列其他细胞系合成的。

已经将G-CSF从人膀胱癌细胞系5637的细胞培养上清液中纯化为同质型（Welte  et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci  82（1985），1526）.编码天然G-CSF的cDNA序列已从Sunza  et  al.，Science  232（1986），61中得知。作为在第二基因内区可变拼接的结果，G-CSF的两个自然发生区与前30个氨基酸代表一个信号肽的204或207个氨基酸同时存在，（Lymphokines，IRL  Press，Oxford，Washington  D.C.，Editors  D.Male  and  C.Rickwood），这种天然蛋白质的分子量大约为19.6KD，并有5个能形成分子内或分子间二硫键的半胱氨基残基，结合研究表明，G-CSF与中性粒细胞结合，与红血球、淋巴嗜酸性细胞系以及与巨噬细胞没有观察到或只观察到有微弱的结合，G-CSF受体由一个分子量为150KD的单肽链组成（Nicola，Immunol.Today  8（1987），134），每个细胞的受体数通常随细胞的成熟而增加并能达到每个细胞数百个。据推测，淋巴因子受体是由一个结合配体细胞外区、一个疏水运输膜区以及一个细胞内区组成。淋巴因子与其受体的结合能导致环核苷酸的合成，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇酯的水解以及蛋白激酶C的活化和细胞内钙水平的提高。有趣的是这些过程如何影响细胞的代谢，但目前仍很难理解，配体与它的受体结合的进一步的结果是通过一种受体依赖的细胞内吞作用，将受体一配体复合体迁移到细胞内。显然淋巴因子（即G-CSF）也发生这种类型的内化，然而，细胞代谢的结果仍不清楚。

由于G-CSF能够在短时期内，大量提高中性粒细胞的数量，可考虑把G-CSF用于治疗学领域，因此，G-CSF可能用于例如癌化学疗法后，免疫系统的细胞被破坏。另外G-CSF能用于骨髓移植、严重的灼伤、因免疫缺失而引起的机会致病菌的感染以及白血病，为了不同类型的治疗有必要发展高活性和低活性型的G-CSF。本发明的目的是通过点突变的特点特异导入而发展具广谱活性的G-CSF分子。在这一过程中，活性的改变将通过尽可能小的氨基酸序列的改变来达到。

本发明的目的是通过对粒细胞刺激因子（G-CSF）或G-CSF变异体，在有174个氨基酸的成熟G-CSF的Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile序列中的50到56位点上或在有177氨基酸的成熟G-CSF的53到59位点上的一个或几个氨基酸进行诱变处理或/和对174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156或170位点上或177氨基酸的成熟G-CSF46，82，159或173位点上，4个组氨酸中的至少一个进行诱变处理而达到的。

新氨基酸的意外导入产生了有广谱活性的G-CSF突变蛋白。活性的测定可按照例如Biochem.J.253（1988）213-218;Exp.Hematol.17（1989）116-119;Proc.Natl.Acad.Sci.USA83（1986）5010完成。

按照本发明，术语G-CSF或G-CSF变异体包括所有有或没有前导序列的G-CSF的自然产生的变异体以及通过DNA重组技术修饰从它衍生出的G-CSF蛋白质。特别是除G-CSF部分外还含有多聚肽序列的融合蛋白质。在这种意义上，G-CSF突变蛋白优选的是在位置-1上带有N末端Met残基，以适合在原核细胞中表达。另外优选的是一个重组体，即能按照PCT/EP91/00  192生产的甲硫氨酸一游离的G-CSF变异体。术语“诱变处理”是指使有关的氨基酸缺失或最好是被其他氨基取代。