[发明专利]一种乳猪肝脏刺激生长因子的制备工艺

说明书

本发明涉及一种生化制剂的提取方法，更具体地说是对乳猪肝脏刺激生长因子的制备工艺。

近年来，国内利用人胎肝细胞悬液在治疗病毒性肝炎和重症肝炎方面取得了突破性进展，目前已探明其治愈肝炎的有效成份是人胎肝细胞悬液中含有一种生物活性较高的肝脏刺激生长因子（HSS），它能促进受损肝脏细胞DNA合成，刺激肝脏细胞再生，使肝病损伤得到修复。但是，由于人胎肝来源困难，储存不便和未经纯化诸原因，人胎肝的应用受到很大限制。而且，肝脏刺激生长因子（HSS）的制备也十分复杂和困难，70年代，美国有科学家从乳猪肝中纯化提制出肝脏刺激生长因子（HSS），他的工艺流程是选用健康乳猪经照光24小时后第二天处死取肝，将肝捣碎加入0.9%氯化钠液放置95℃水浴箱15分钟后取出，经27000g/分（高速）离心20分钟后，在4℃环境下收集上清液再加入6倍的冷酒精沉淀，经4℃下微振荡2小时，再高速离心20分钟，此时加入缓液稀释，即得到乳猪肝脏刺激生长因子的粗制品经Dye  Ligand层析再由DEAE离子交换葡聚糖凝胶G-75过柱，再选用Sephcose  4B亲和层析，即得到纯肝脏刺激生长因子的精品。这和提制方法需用大量高精仪器和大型设备、工艺流程十分复杂，尤其是在葡聚糖凝胶层析、亲和层析过程中，需用昂贵的化学试剂才能提制精品，整个提制过程中周期长，而且得到肝脏刺激因子精品活性较低。造成肝脏刺激生长因子精品昂贵，严重阻碍肝脏刺激生长因子临床的广泛应用，因此，肝脏刺激生长因子的制备工艺改进，是促进这一生化制剂广泛应用于临床亟待解决的问题。

本发明的目的是利用现有国产仪器设备，采用改进和自行设计的工艺方法，从乳猪肝脏提取肝脏刺激生长因子，简化制备工艺，降低生产成本，提高肝脏刺激生长因子的活性度和产量，促进这一生化制剂的广泛应用。

本发明的目的是这样实现的：取健康乳猪（5公斤重）的肝脏，加入蒸馏水捣成匀浆，加入缓冲剂，常温下搅拌一小时提取，将提取物放置水浴箱内加热至95℃，15分钟后过滤，取出滤液，加入95%乙醇沉淀，在4℃下静置5小时后过滤，再将沉淀溶于0.02MPH7.2的磷酸盐缓冲液中，加入离子交换剂（DEAE），在常温下搅拌2小时过滤，用磷酸盐缓冲液洗涤离子交换剂至没有乳白色后进行装柱，分别用0.36～0.38%氯化钠液（A液）和0.68～0.7%氯化钠液（B液）两种不同浓度的溶液洗柱，收集B液洗脱的组分，按其所获得的体积计算加入5倍磷酸盐缓冲液（C液），即得到肝脏刺激生长因子的精品。

本发明制备工艺方法的具体步骤如下：

选用上述改进的制备工艺，其方法简便，不需高精复杂的仪器设备，省去低温高速离心、省去葡聚糖过柱和亲和层析两种复杂的方法，对所获得的乳猪肝脏刺激生长因子，经蛋白质和生物活性测定，都优于国外制备工艺产品，而且可获得的产量多，经药理急性毒性试验证示无毒付反应，同时，临床应用证明，该肝脏刺激生长因子具有稳定、纯净、疗效明显的特点。