[发明专利]关于人消化酶的重组蛋白及其制备方法

说明书

本发明涉及新的DNA序列，由这些DNA序列编码的新的蛋白质，以及这些蛋白质的用途，正如下面要进一步描写的。本发明还包括载体，如包含能表达所需酶之DNA序列的质粒构建体，本发明还包括由这些构建体转染的宿主生物体，如细菌、酵母、哺乳动物细胞及转基因动物。本发明还包括制备本发明之新产品的方法。本发明的新蛋白质涉及酶，即所谓人胆盐刺激脂酶。

人泌乳乳腺可合成并随乳汁分泌一种胆盐刺激脂酶(BSSL)〔1〕，其在受初级胆盐特异性激活之后〔2,57,58〕，可为乳儿提供内源性肠内脂肪消化的能力〔3-5〕。该酶是一种非特异性脂酶，约占总乳汁蛋白质的1％〔6〕；其在体外不仅可水解三、二和一酰基甘油，而且还可水解胆甾烯基和视黄基酯，以及溶血磷酯酰甘油〔7-10 〕。此外，其活性不只限于乳化底物，而且可以相似速率水解微胶粒及可溶性底物〔11〕。

BSSL在与乳汁一起通过胃时不会被降解，而且在十二指肠中可受到胆盐的保护而不至于被胰脏蛋白酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶灭活〔2,11〕。但当乳汁被巴氏消毒，如加热到62.5℃,30分钟时即可失活〔12〕。体外模型实验提示，在BSSL存在下，三酰基甘油消化的终产物是不同的〔5,7〕。由于婴儿初生期同管腔内胆盐浓度较低〔13,14〕，故这种差异可有利于产物吸收〔5,15〕。

人胰液的羧酸酯水解酶(CEH〕在功能上似乎相同或至少很相似于BSSL〔8〕。它们带有共同的抗原决定基〔8,17〕，有相同的N末端氨基酸序列〔17〕，而且均可被丝氨酸酯酶，如毒扁豆碱和二异丙基氟磷酸酯这类抑制剂所抑制〔6,8,16〕。已推测两种酶是同一基因的产物〔18,19〕。如最近有报导所提示的〔17〕，可将所观察到的分子大小差异〔8,19〕解释为糖基化作用的形式不同。

食物脂肪是重要的能量来源。高能三酰基甘油占这些脂类的95％以上。某些脂类，如某些脂肪酸和脂溶性维生素是基本营养成份。在胃肠吸收之前，三酰基甘油及较小组分，即酯化的脂溶性维生素和胆固醇，以及二酰基磷酯酰甘油(diacylphosphalidylglyce-rols)，须经水解酯键，以产生有较小疏水性的可吸收产物。这些反应都是由一组称为脂酶的特定酶类催化的。

参与成人体内上述代谢过程的重要脂酶被认为是胃脂酶，胰共脂酶依赖性脂酶(水解三和二酰基甘油)、胰磷脂酶A2(二酰基磷酯酰甘油)及羧酸酯水解酶(胆甾醇和脂溶性维生素酯)。在哺乳婴儿体内，胆盐刺激脂酶对于水解上述几种脂类物质起着重要作用。这些脂类消化产物连同胆盐一起形成混合胶束，以此发生吸收作用(3-5)。

消化道内胰共脂酶依赖性脂酶和/或胆盐水平降低，是引起脂类吸收障碍，进而导致营养不良的常见原因。这种脂酶缺乏的典型实例是患有胆囊纤维变性(为一种在约80％病人中导致终生脂酶缺乏的遗传性疾病)和慢性胰腺炎(常常是由于慢性酒精中毒所致)的病人。

出生时，特别是未足月出生的婴儿，胰和肝脏功能尚未发育完全，常常发现有生理性脂肪吸收障碍并被认为是由消化道内胰共脂酶依赖性脂酶及胆盐浓度低引起的〔3,4,13-15〕。但由于存在BSSL，这种吸收障碍在哺乳婴儿中要比喂消毒婴儿配制人乳的婴儿少得多(3-5,12,59,60,61)。这就是为什么新生儿，特别是早产婴儿，当不能喂自己母亲的奶时，提倡喂以别的妈妈的未消毒奶的一个原因。

目前对胰脏脂酶缺乏病人的治疗是口服大剂量的猪胰脏酶粗制品。低PH下可使共脂酶依赖性胰脂酶失活，在胃中很容易出现这种情况，结果使得口服的胰脂酶在通过胃进入肠道时最终完全被失活。因此，使用大剂量酶制剂并不能完全达到上述治疗目的。即使大剂量给药，对多数病人仍显不足，而且这些制剂都不纯，也很难吃。已将这些制剂制成片剂，使之通过胃的酸性区域，并只能在空肠的相对碱性环境中释放出酶。然而，许多患胰脏疾病的病人，空肠内常常呈异常的酸性环境，而这种片剂不能释放出酶，因而使之失效。此外，因为市售制剂是非人来源的，故存在出现免疫反应的危险，并可能对病人造成有害影响或使疗效降低。这种制剂的另一个缺点是，它们含有未曾提到的，共脂酶依赖性脂酶以外的其它脂解活性物质。事实上，它们中的大多数只含有很低水平的CEC/BSSL活性。这就是为什么许多患胆囊纤维变性的病人，尽管施以维持疗法，仍会有脂溶性维生素和基本脂肪酸缺乏的一个原因。