[发明专利]核糖体失活蛋白质，其无活性的前体形式，及其制造和使用方法

说明书

核糖体失活蛋白质（RIP）是能够催化失活真核细胞核糖体，并且是真核细胞蛋白质合成之极有潜力之抑制剂的植物蛋白质。已将RIP分为两类，即1型和2型RIP（参见Barbieri  and  Stirpe（1982），Cancer  Surveys，1∶489-520）。1型和2型RIP成员之间，以及与也具有同样作用机理的细菌的Shiga和Shiga样毒素之间有着显著的氨基酸序列同源性（参见Hovde  et  al.，（1988），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶2568-2572）。

2型RIP由两条多肽链组成;通过二硫键共价结合到凝集素样蛋白质（或B链）上的RIP（或A链）对细胞表面碳水化合物有亲和性。B链与细胞表面结合并有利于继后RIP  A链部分的细胞内在化，从而导致蛋白质合成的迅速失活和细胞死亡。因此2型RIP是效力极强的细胞毒素和动物毒剂，其中研究最多的是蓖麻蛋白。

相反，迄今所知道的1型RIP则是由一条活性与A链相当的多肽链构成的，而缺少共价结合的B链。因而，它们对完整细胞几乎没有毒性，而保留其极好的抗无细胞蛋白质翻译系统的能力。一般百分之五十抑制无细胞蛋白质翻译的浓度（IC₅₀）为0.5-10ng/ml（0.16-33pM）。在获得下文详述的发现之前，已报导1型RIP与分子量约30，000的碱性蛋白质有显著的同源性。1型RIP可见于多种双子叶和单子叶植物中，并可能是普遍存在的。如在植物的种子、根和乳胶细胞中存在有丰富的蛋白质。它们的体内功能尚不明了，但已有报导它们可能是抗病毒剂（Stevens  et  al.，（1981），Experientia，37∶257-259）或抗真菌剂（Roberts  and  Seltrennikkoff（1986），Bioscience  Reports  6∶19-29）。

迄今为止，已有一篇文章讨论了玉米，以及其它谷物中存在有动物无细胞蛋白合成抑制剂（Coleman and Roberts（1982），Bio-chimica et Biophysica Acta，696∶239-244）。玉米抑制剂是通过硫酸铵沉淀和磷酸纤维素柱层析法制备的。据信可从玉米中分离到纯的抑制剂。报导的抑制剂分子量为23千道尔顿（KD），且用腹水无细胞蛋白质合成检测法测知ⅠC₅₀为50-100ng/ml。

已检测了RIP对核糖体的作用，发现1型和2型RIP均具有独特的而且高度特异的N-葡萄苷酶活性，该酶可裂解大鼠肝核糖体28S  RNA之腺嘌呤4324的糖苷键（Endo（1988），Immuno-toxins，（ed.）Frankel）。

对RIP的商业兴趣主要集中在将它们与击靶多肽，如最常用的单克隆抗体相结合，用于构建针对特定细胞如肿瘤细胞的治疗性毒素（Immunotoxins（1988），同上）。这一结合产物模拟了2型RIP之B链的结合功能性，但用高度选择的配基置换了它们的非特异性作用。最近发现的另一个潜在应用是用于治疗HIV感染（见美国专利4，869，903号Lifsou等人，（Genelabs  Incorporated  and  Regents  of  the  University  of  California））。

虽然玉米得到的蛋白质合成抑制剂，同由其他禾本科（panicoi-deae）制得的蛋白质合成抑制剂一样似乎可用于构建细胞毒性结合物物，但迄今还没有那一个研究人员报导已成功地使用了禾本科（pani-coideae）RIP。从使用包括大麦等谷物在内的非禾本科植物RIP获得成功的角度看，这是颇令人惊奇的（参见Lambert  et  al.，（1988），In∶Immunotoxins，同上）。迄今本领域人员尚未能按Coleman和Roberts所述成功地利用玉米RIP，其部分原因可能由于尚未完全确定蛋白质合成抑制物的特性。

对于在通用宿主真核细胞中表达重组体RIP有兴趣，是因为其具有提供正确的转译后加工的能力。然而，因于RIP会在真核细胞内有效地抑制蛋白质合成，故推断可能存在异源表达RIP会导致宿主细胞死亡的问题。因此，一般不使用真核细胞作为重组体宿主细胞。虽然可在某些条件下使用真核细胞，但构建RIP时必须使其在细胞受到毒性作用之前分泌出来（参见Gelfand等人（Cetus公司）的欧洲专利EP0335476号）。因此，尽管存在不能糖基化并适当地折迭异源表达的蛋白质等缺点，大多仍使用原核宿主细胞作为宿主。