[发明专利]从葡聚糖明串珠菌克隆和过量表达葡糖－6－磷酸脱氢酶

说明书

葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6p-DH)催化葡萄糖氧化代谢的第一步。在该过程中葡糖-6-磷酸被氧化为葡糖酸-6-磷酸，同时，作为辅助底物的NAD⁺和/或NADP⁺则被还原。葡萄糖的氧化最终导致用于核酸代谢的戊糖的产生。

可从例如肠膜明串珠菌中分离葡糖-6-磷酸脱氢酶。该酶可利用NAD⁺以及NADP⁺于作为辅因子，而来自酵母的该酶则仅利用NADP⁺作为辅因子。该酶以由两个相同的单体亚单位组成的二聚体的形式存在，分子量为55000D，25℃时的比活性为550μ/mg。

从明串珠菌属细菌中分离G6p-DH这一方法的缺点尤其在于乳酸细菌具有复杂的营养要求，因此它们在大技术规模上所使用的营养培养基中只能缓慢生长，并且仅达到很低的细胞浓度。另外，当使用明串珠菌时生物量中G6p-DH的含量极低(约占总细胞蛋白质的1％)。因此，为了提供适量的G6p-DH必需进行大批量发酵。而且，由于存在大量外源蛋白质，故只可能获得低比活性的酶制剂。

但是，从明串珠细菌获得的已知G6p-DH的最大缺点是它们的低温稳定性。

因此，本发明的目的是提供不再具有现有技术中那些缺点的葡糖-6-磷酸脱氢酶。

本发明的这一目的是通过提供这样一种葡糖-6-磷酸脱氢酶而达到的：它含有SEQ ID No：1中所示的氨基酸序列并且可得自肠膜明串珠菌葡聚糖明串珠菌亚种(DSM 20187)(以下称作葡聚糖明串珠菌，Leuconostoc dex-tranicus)。

另外，本发明也提供了含有SEQ ID No：1中所示的编码本发明酶的序列或含有遗传密码简并性范围内相应序列的DNA。

本发明的重组DNA是利用下面将详细叙述的合适寡核苷酸探针对葡聚糖明串珠菌(DSM 20187)进行筛选而分离出来的。

当本发明的重组DNA在大肠杆菌细胞中表达时会令人惊奇地发现，即使是小发酵体积也足以提供所需量的酶。与从明串珠菌分离G6p-DH相比，发酵体积减少500至1000倍。而且，在较少增加纯化步骤的情况下得到高纯度的G6p-DH制品(即比活性约为900μ/mg)。但是，与自大肠杆菌分离的已知酶相比，本发明重组酶的一个令人惊异的特殊特征是其温度稳定性得到根本改善。与已知明串珠菌酶相比，该重组酶的另一个优点是它不与葡萄糖反应。这一熟知的明串珠菌酶与葡萄糖的非特异性反应(Olive and Levy，Biochemistry6(1967)，730)以前一直是酶试验中的一个主要缺陷，因为这将由于血液、血清或血浆中葡萄糖的存在而导致错误的测定结果。最后，重组酶与已知G6p-DH的不同还在于：对NADP⁺的Km值不同，激活剂和抑制剂(如磷酸酯、甘油、镁离子、碳酸氢根离子等)的作用不同。

本发明也提供了含有本发明重组DNA之一个或多个拷贝的重组载体。该载体能够在外来宿主体中表达本发明的重组DNA。本发明的载体可以整合到宿主细胞染色体DNA上(如λ噬菌体)，也可存在于宿主细胞染色体外(如质粒)。本发明的载体最好是质粒。

本发明的载体可以是真核载体，也可以是原核载体，但最好是原核载体，即它适于在原核宿主生物体中增殖。该重组载体最好具有在大肠杆菌中有活性的复制起点，即它能够在大肠杆菌中增殖。

在一特别优选的实施方案中，本发明的重组载体含有受控于在大肠杆菌中发挥作用并包括SEQ ID No：1中所示前122个核苷酸(G6p-DH基因的上游)之葡聚糖明串珠菌启动子序列的编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列。

为了显示出启动子性质，并不要求DNA区域完全具有这122个核苷酸的序列。具有启动子作用的这一序列的衍生序列或其片段也是适用的。应当知道，在衍生的生物学活性序列的情况下，启动子序列中的单个核苷酸或短核苷酸序列可被缺失、取代或插入，而只要其启动子活性被保留就行。本领域熟练技术人员的确知道，对于一个启动子来说并不一定要保留整个序列，而只需保留特定的部分区域。在原核启动子序列中，则尤其是距转录起始点-35位和-10位的区域。

因此，本发明也包括含有SEG ID No：1中所示核酸序列中之前122个核苷酸或由之衍生的具有启动子性质之序列的重组DNA。令人惊奇的是，该明串珠菌启动子在大肠杆菌中也能导致蛋白质的很好地表达。因此，该启动子也可用以在革兰氏阴性菌(优选大肠杆菌)中表达异种基因，即不同于G6p-DH基因的基因。