[发明专利]肿瘤坏死因子生成的抑制剂，其制备方法和用途

说明书

本发明是关于肿瘤坏死因子生成的抑制剂，以及将经脂多糖刺激的巨噬细胞或单核吞噬细胞用于制备这些抑制剂的方法，以及这些抑制剂作为治疗和预防由肿瘤坏死因子引起的疾病的应用。

炎症反应是免疫机制的过度表达，这种机制的存在本来是为了保护宿主机体的。最近几年已经明白，由宿主形成的蛋白质可能以游离形式引起炎症终末介质的释放，从而产生疾病症状。这种激素样蛋白质称作组织介素（Gupta，Scand  J  Rheumatol  Suppl.，（1988）76，189）。现已确定，组织介素对于炎症过程的发展是至关重要的。

在组织介素中，肿瘤坏死因子（TNF）对于急性炎症的发生尤其重要，因为这种物质（主要由巨噬细胞产生）能导致哺乳动物处于菌血症和脓毒症特有的休克状态（Tracey等，Science，234，（1986），470）。进一步的发现表明，抗TNF单克隆抗体可降低患细菌性脓毒症的猴子的死亡率（Tracey等，Nature，330，（1987），662）。这些发现清楚地表明，TNF对于内毒素休克的许多特征的发生是充分且必要的因子。

这种内源性TNF生成与急慢性炎症之间的明确联系已导致许多尝试，即用药理学抑制剂来阻断内源性TNF的生成。可以举出用甾体、黄嘌呤衍生物和脂氧酶抑制剂进行治疗的实例（Zabel等，Lancet，23，（1989），1474）。另一事实是组织介素IL4（白细胞介素4）也是一种TNF生成的抑制剂（Essner等，J.Lmmunol.142，（1989），3857）。

本发明之目的是寻找可以抑制内源性TNF生成的新的生理学抑制剂。

令人惊奇地发现，巨噬细胞或单核吞噬细胞能够产生TNF生成的抑制剂。

因此，本发明是关于：

1.肿瘤坏死因子生成的抑制剂（以下称TIM），它们可通过来自对脂多糖耐受的脊椎动物的巨噬细胞或单核吞噬细胞的培养获得。

2.以1项表征的抑制剂的制备方法，其特征是对脂多糖耐受的脊椎动物的巨噬细胞或单核吞噬细胞进行培养，然后再加入脂多糖。

3.以1项表征的抑制剂的应用，即制备用来治疗或预防由肿瘤坏死因子引起的疾病的药物。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的成分。它由类脂A和各种多糖组成，因细菌种类不同而包含各种糖的成分。LPS作为一种内毒素，可导致发热、白细胞减少和增多，产生兔体内局部施瓦茨曼反应。例如，脂多糖可用酚-水法从弗里德瑙沙门氏菌中提取出来，冷冻干燥并转变为三乙胺盐形式（Galanos等，Zentralbl  Bakteriol.Parasitenkd.Infektionskd.Hyg.Abt.1：Orig  Reihe  A：243，（1979），226）。肿瘤坏死因子（TNF）是一种特别是由巨噬细胞产生的组织介素，具有溶解某些转化细胞素的活性。

IL4是一种B细胞生长因子，它的作用是活化巨噬细胞，分子量为15，000-20，000。IL6是一种B细胞分化因子，它以杂交瘤细胞系的生长因子发挥作用，分子量为22，000-34，000。

本发明的TNF抑制剂是一种产品，其特征概括如下：

-分子量为40，000-80，000

-通过巨噬细胞抑制TNF的合成

-不象白细胞介素6那样作为杂交瘤细胞系的生长因子发挥作用。

例如，抑制剂可以由对脂多糖耐受的脊椎动物的巨噬细胞产生。合适的例子是从对脂多糖耐受的NMRI小鼠或C3H/HeJ小鼠中获得巨噬细胞（NMRI表示海军医学研究院）。而且，人的单核吞噬细胞也可用于产生本发明的抑制剂。

本发明的抑制剂的最佳制备方法是先在脊椎动物身上诱发对LPS的耐受性。例如可选用NMRI雌性小鼠（6-8周，Lippische  Versuchstieranstalt，Dextertal，德国），通过腹腔注射含大约80微克LPS的200微升无热原的缓冲液，从而产生对LPS的耐受性，注射用LPS系用酚-水法从弗里德瑙沙门氏菌中获得。96小时后，小鼠则处于对LPS耐受状态，此种状态由下法显示，每只小鼠注射2毫克LPS后，耐受小鼠无一死亡。而正常小鼠的LD₁₀₀为0.7毫克。