[发明专利]利用家蚕高效表达天花粉蛋白及其他有用蛋白的方法

说明书

利用家蚕高效表达天花粉蛋白及其他有用蛋白的方法

基因工程技术。本发明是利用基因工程技术，通过构建的新型转移载体质粒和分离的家蚕核型多角体病毒HB毒株，在家蚕体内高效表达天花粉蛋白，进而可用于生产其他有用蛋白。

基因工程使利用重组DNA技术，在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母及哺乳动物细胞中生产人们所需要的蛋白质及药物等成为可能。

近年来建立的杆状病毒载体表达系统，以两种昆虫病毒，即苜蓿尺蠖核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒为载体在昆虫培养细胞及昆虫活体内表达了数十种外源基因。并证实该系统表达的外源蛋白具备天然性质，可作为检测试剂、药物、疫苗等。

已有的研究结果表明，虽然在家蚕体内表达外源基因、生产有用蛋白的效率受多种因素的影响，但其中最关键的是用于构建重组病毒、供外源基因插入的转移载体质粒的结构。在转移载体质粒中，多角体蛋白启动基因的完整性可使表达效率相差几倍甚至几十倍。而多角体蛋白基因下游的序列对外源基因转录及翻译的终止也有影响。特别是现有的家蚕核型多角体病毒载体的转移载体质粒尚不完善。

本发明采用新兴的PCR技术，通过人工合成的寡聚核苷酸引物对所克隆的多角体蛋白基因的旁侧序列进行了定点改造，册除了全部结构基因部分，保留了完整的5′端及3′端序列，并插入了合适的多聚接头，使新构建的转移载体处于最理想状态，保证了外源基因在此完整启动子的控制下，可获得高效表达。并且在3′端下游序列中，引入了三套终止密码子TAA，无论外源基因是否含有终止密码，在本载体中表达均能有效地终止。

因而，本发明旨在通过构建理想的转移载体质粒，提高利用家蚕核型多角体病毒在家蚕体内表达外源基因的表达效率。

家蚕核型多角体病毒是家蚕血液型脓病的病原体，该病毒属于杆状病毒科的A亚组。在野外该病毒只感染家蚕、野蚕、蓖麻蚕等少数几种昆虫。野生型家蚕核型多角体病毒有许多分离株，它们的多角体形态和限制性内切酶酶切图谱不同。本发明选择能形成四方形多角体的HB分离株为材料，该分离株不仅多角体大于一般六角形多角体，而且很均整，这些特性为构建高效表达载体提供了基础。其表达载体的构建方案如下：

已知家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白结构基因位于该病毒基因组EcoRⅠ  10.6kb片段内。该片段可通过构建家蚕核型多角体病毒的基因文库，从文库中筛选获得。

通过菌落原位杂交，Southern杂交等常用分子生物学实验方法可对所得到的目的片段进行分析、鉴定。进而用一系列限制性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，可绘制出该片段的酶切图谱。在多角体蛋白结构基因上游（5′端）有一XhoⅠ位点，下游（3′端）有一BamHⅠ位点。分别位于上游1.8Kb和下游1.3Kb。包括结构基因在内，该XhoⅠ-BamHⅠ片段的大小为3.8Kb。从EcoRⅠ  10.6Kb片段中，可进一步克隆到该XhoⅠ-BamHⅠ  3.8Kb片段。

利用链终止法对多角体蛋白结构基因及上、下游区域进行序列分析，测得HB分离株的多角体蛋白结构基因的编码序列为738bp，另外从上游-196bp至下游+750bp范围内共有4bp的碱基序列发生了变化。

以上述克隆在载体质粒Bluescript的XhoⅠ/BamHⅠ位点的XhoⅠ-BamHⅠ 3.8Kb片段为模板，根据测定的多角体蛋白基因结构基因上游及下游序列合成一对引物，并以通用引物T₇和T₃与之相配合，分别扩增多角体蛋白结构基因的5′端1.8Kb及下游1.3Kb区域，在人工合成的引物中，分别引入了HindⅢ和XbaⅠ切点，并使原多角体蛋白基因的启始密码子ATG改为AAGCTT（HindⅢ切点）;而在3′端引物XbaⅠ的下游加入了三套终止密码子TAA。经聚合酶链式反应30个循环的扩增，分别获得多角体蛋白基因上游1.8Kb片段a和下游1.3Kb片段b。将片段a和b用XhoⅠ、HindⅢ酶切;片段b用XbaⅠ和SacⅠ酶切，分别克隆于Bluescript的XhoⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/SacⅠ切点。

扩增的XhoⅠ/HindⅢ  1.8Kb片段含有完整的多角体蛋白基因启动子，XbaⅠ/SacⅠ  1.3Kb片段含有多角体蛋白基因转录终止信号及通过引物合成引入的三套翻译终止密码子。然后，从XhoⅠ到Bluescript的XbaⅠ切点（含片段a）切下，克隆到片段b的上游XhoⅠ/XbaⅠ位点，为完整的家蚕核型多角体病毒转移载体质粒。该载体具备：

（1）完整的启动子序列

（2）3′端转录终止及翻译终止信号