[发明专利]发酵生产肌苷的分离纯化方法

说明书

本发明涉及工业发酵生产肌苷过程中肌苷的分离纯化工艺。

肌苷，又名次黄嘌呤核苷，可作制备助鲜剂肌苷酸的前体，也是一种对心脏病、肝病、白血球及血小板减少症有明显疗效的药物。目前工业生产肌苷以发酵法为主，由于所使用的菌种（有枯草杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌等）和发酵培养基及发酵条件不同，产苷率由千分之几到千分之几十，水平不一，发酵液中除肌苷外，还含有大量的次黄嘌呤及其他非肌苷物质，因此必须使用分离纯化的方法，把肌苷从发酵液中提取出来并与理化性质相似的次黄嘌呤分开，才能获得高纯度的肌苷产品。现有工业上的提取分离方法均需经过离子交换树脂柱及活性炭柱进行分离，其工艺过程大致如下：发酵液→离子交换树脂柱分离→上活性炭柱→真空浓缩→结晶→活性炭脱色重结晶→成品，也有先经活性炭柱再经离子交换树脂柱的。这一工艺流程一般约需2～3天，而且由于使用离子交换树脂柱和活性炭柱而需用大量的酸、碱，这一工艺的主要缺点是工时长，劳动强度大，所需设备多，成本高，对环境污染严重，而且肌苷收得率低（一般在60%左右）。

本发明的目的是提供一种发酵生产肌苷的分离纯化工艺，它不需使用离子交换树脂柱、不需或大大缩小使用活性炭柱的规模，从而克服上述已有技术所存在的缺点。

本发明革除了现有工艺中的离子交换树脂柱分离工序，同时革除或大大缩小了活性炭柱分离规模，而采用直接浓缩结晶的方法。该方法的关键是必须先除去肌苷发酵液中的菌体，但由于菌体体积小，发酵液粘度大，过滤或离心均比较困难。本发明采用絮凝技术较好地解决了这一问题。

本发明的方法是：先在肌苷发酵液中加入絮凝剂，使发酵液中的菌体颗粒变大连成絮状，然后用离心或过滤方法除去菌体，将已除去菌体的发酵液进行浓缩、结晶，所得为粗结晶（含肌苷60～70%），经重结晶即可得到高纯度的肌苷产品。按此工艺方法，肌苷的收得率可达65～75%。

为了进一步提高肌苷的收得率，可将上述第一次粗结晶的母液进行除杂处理（例如用活性炭吸附，再用洗脱液洗脱），然后进行第三次浓缩、结晶，所得粗结晶与上述第一次的粗结晶合并进行重结晶。这样可将肌苷收得率提高到70～80%。

下面对本发明工艺的具体步骤作进一步的描述。

1.在肌苷发酵液中加入絮凝剂，一般的无机或有机絮凝剂均可以使用，较常用的有KJT、聚丙烯酰胺、脱乙酰甲壳素等，但从无毒、安全及效率等方面考虑，则以脱乙酰甲壳素为佳。絮凝剂用量一般为发酵液总量的100～500ppm。若先将发酵液调至偏碱性（通常为PH9-10），则絮凝效果更好。发酵液加入絮凝剂后，其中的菌体颗粒变大连结成絮状，很易与清液分离，此时可采用离心或过滤的方法除去菌体。工业生产中以压滤或抽滤较好，必要时可渗加助滤剂。

2.将除去菌体后的发酵液调至偏碱性（一般为PH9～11），在60℃以下（温度低有利于浓缩），0.1MPa以下进行真空浓缩，通常浓缩至原体积的1/6～1/8（含苷60～75‰）。

3.将2所得浓缩液调PH11～11.5，然后置0～10℃低温中进行结晶，结晶完全一般约需24～35小时。

4.上述结晶后的母液还含有少量的肌苷，可通过第三次结晶提取出来，但母液中也含有较多的次黄嘌呤及其他杂质，所以需要除去，可采用吸附法及离子交换法等。以吸附法为例：母液采用颗粒活性炭吸附，再用洗脱液洗脱，然后对洗脱液进行第二次浓缩、结晶，工艺条件与上述步骤2和3第一次浓缩、结晶相同。所用的洗脱液可以是热碱（例如：85℃，1NNaOH）或NaOH-乙醇溶液，以1NNaOH-（10～50）%乙醇溶液为佳。

5.将上述步骤3和4两次结晶（粗苷）合并，用4～6倍（重量）蒸馏水溶解，调PH6.0～6.2，再经粉末活性炭脱色后进行重结晶，即得到高纯度的肌苷产品。

本发明工艺与已有技术相比，具有如下优点：

（1）革除了离子交换树脂柱和活性炭柱分离工序，只有进行第二次浓缩结晶时才需用少量活性炭对第一次结晶母液作除杂处理，从而节省了大量酸碱及工时，既减轻了劳动强度又改善了劳动环境。

（2）与现有工艺相比，肌苷收得率可提高10～15%，而提取工段的成本可降低30～50%，同时可节能20～40%。

（3）菌体可回收综合利用，干菌体含较丰富的蛋白，可作饲料。同时，解决了肌苷生产过程中废水排放污染环境的问题。

以下是本发明的一个实施例：

以枯草杆菌为菌种的肌苷发酵液4升（含苷9.09‰，折纯苷36.36克），将发酵液调pH9.8后加入脱乙酰甲壳素（醋酸溶液），使浓度达200ppm，搅拌均匀后，室温静置30分钟至1小时，过滤;将所得清液调pH10，于50～60℃，真空度0.092MPa，浓缩至约为原体积的1/7（约含苷63～65%）;将浓缩液调pH11后于4℃结晶30小时，得粗苷（粗结晶）43.25克（含苷为64.74%）;上述结晶母液调pH3.0后，上769^＃颗粒活性炭柱，吸附后，以1NNaOH-30%乙醇溶液洗脱得800ml洗脱液，将洗脱液调pH9.8后，按前述条件进行第二次浓缩、结晶，得粗苷3.6克（含苷64.59%）;将两次所得粗苷合并（收率为83%），加入200ml蒸馏水，于75℃溶解后调pH6.0～6.2，加入粗苷量的（4～5）%的粉末活性炭，维持pH6.0～6.2，并于80℃温度下搅拌保温30分钟，过滤，滤液于0～5℃结晶30小时，得纯品肌苷27.5克，经测定纯度为100%，不含次黄嘌呤，产品完全符合部颁药检标准。总收率为75.6%。