[发明专利]转拼核酶

说明书

本发明涉及新的能够进行转拼反应的核酶。

Ⅰ.Ⅰ组内含子

具有催化活性的RNA分子称为核酶或RNA酶（Cech，T.R.，Ann.  Rev.  Biochem.  59：543-568（1990））。嗜热四膜虫（Tetrahy-mena  thermophila）前体rRNA含有能够催化其自身切割的内含子（核酶）。该核酶是一组结构上相关的Ⅰ组内含子中的一种。

修饰过的嗜热四膜虫内含子的拼接活性需要有鸟苷辅因子和二价阳离子（Mg⁺⁺或Mn⁺⁺）存在，并且是通过两个连续的转酯反应（图1）发生的。首先，游离的鸟苷与核酶结合且其3′羟基被置于攻击5′拼接位点的磷原子的位置。鸟苷共价连接于内含子序列并释放出5′外显子。接着，新释放出的5′外显子的3′羟基与位于3′拼接位点的磷酸二酯键反应，从而产生连接的外显子序列。然后，切除的内含子通过一系列的转酯反应（涉及其3′羟基和内部序列）形成缩短了的环形分子。

从化学上讲，这些连续反应是相似的并且都发生在单一活性位点。自拼反应的特征在于交替RNA结构的形成，因为不同的RNA链均在高度保守的内含子周围形成了类似的构象。拼接需要对准位于称作“内部指导序列”（或IGS）的互补序列内含子一外显子接点。

在5′拼接位点进行的首次切割需要在IGS和与拼接位点相邻的序列之间形成碱基配对的螺旋（P1）。该螺旋中U：G“变位”碱基对的存在可限定将在核酶的催化反应中破坏磷酸二酯键。该键断裂后，部分P1螺旋被取代，且由于IGS和与3′拼接位点相邻的序列之间的互补性而形成了新螺旋（P10）。不变的鸟苷残基位于3′拼接位点处的磷酸二酯之前，如同P1序列中被取代的部分一样。因此，外显子的连接仅在新的外显子序列取代了内含子序列之处以与第一次切割反应相反的方向发生。应当指出，紧接外显子连接反应的内含子环化反应同样也涉及5′序列与IGS的碱基配对，而且反应是由内含子末端鸟苷残基的3′羟基介导的（Been，M.D.et  al.，“Selection  of  Circularization  Sites  In  A  Group  I  IVS  RNA  Requires  Multiple  Alignments  of  An  Internal  Template-Like  Sequence，”Cell  50：951（1987））。

Ⅱ.催化活性

为了更好地确定Ⅰ组内含子的结构和催化性质，已从嗜热四膜虫内含子“核心”中剥去外显子序列。Cech，T.R，等（WO  88/04300）曾指出，嗜热四膜虫内含子核酶至少具有三种催化活性：（1）脱磷酸活性，它能够以序列特异性方式除去RNA3′末端的磷酸，（2）RNA聚合酶活性（核苷酸基转移酶），它能够催化寡核糖核苷酸转化为多核糖核苷酸，（3）序列特异性核糖核酸内切酶活性。

分离的核酶活性能够与底物RAN进行相互转移作用，且已对这类反应进行过鉴定。例如，当将平末端形式的内含子和对应于5′拼接点的序列一起保温时，该位点受到类似于拼接第一步的鸟苷依赖性切割。底物与核糖核酸内切的内含子RNA进行碱基配对，形成螺旋P1，且切割发生在第4-6位的U：G碱基对之后。通过系统发育比较和突变分析发现，只要维持了P1螺旋的碱基配对，紧接5′拼接位点处保守尿嘧啶残基的序列的性质对催化作用并不重要（Doudna，J.A.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：7402-7406（1989））。

选择3′拼接位点所需的序列似乎主要位于内含子本身的结构内，它包括螺旋I9.0以及随后的确定3′内含子边界的鸟苷残基。但是，如同突变分析所显示的一样，3′外显子内的侧翼序列是形成螺旋P10以及进行有效拼接所必需的（Suh，E.R.et  al.，Mol.Cell.Biol.10：2960-2965（1990））。另外，利用平末端形式的内含子和“外部”指导序列以及已被5′鸟苷残基延长的寡核苷酸，已将寡核苷酸转移连接。在连接之前，通过在外部模板上形成类似于P10的螺旋而单独对准对应于3′外显子序列的底物寡核苷酸（Doudna，J.A.et  al.，Nature  339：519-522（1989））。