[发明专利]用蛋白质胶涂层软片鉴定筛选定量定位蛋白酶的方法

说明书

本发明涉及一种用明胶之类蛋白质胶涂层软片作底物的鉴定、筛选、定量、定位蛋白酶的方法。

生物，尤其是微生物和植物蛋白酶往往具有资源丰富，价格低廉的特点，因而易被大量开发。如市场上销售的糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶等，就是典型例子。

自然界生物种类繁多。不同的生物内所含的蛋白酶常常因具有不同的切点和不同的最适反应条件等性质而可得以有不同的应用。而筛选开发这些不同性质甚至性质特异的新蛋白酶种，就具有重大意义了。以往寻找有开发利用价值的新酶种，主要是采用酪蛋白法，DHT酪蛋白法这类人工底物来测定蛋白酶活性。在采用酪蛋白法时，需要昂贵的设备，而采用合成底物的成本也很高。如DHT酪蛋白每克需10元人民币，BAEE、BTEE等小肽甚至每克达到上百美元。单做一次测定，试剂成本就需高达数十、乃至数百元人民币。同时，由于生物多数都含有色素，比如叶绿素、花青素、胡萝卜素、血红素等，它们的存在强烈地影响了常规的酪蛋白法测定时的紫外比色。显然，蛋白酶筛选这种大规模的测试工作，由于需要复杂的仪器设备，昂贵的试剂成本而难以在野外进行。

本发明的目的在于寻找一种方法简单，成本低廉，易于操作的筛选、定量和定位蛋白酶的新方法。这种方法可通过软片底物与被测定的微生物匀浆或动植物组织反应后软片是否出现蛋白酶水解斑及水解斑的透明度和大小形状而直接、直观地鉴定该被测物是否含酶，含酶部位及含酶量的多少，而且适于野外操作。

本发明是采用附有明胶之类蛋白质胶及银粒子或碳黑之类有色物质层做药膜的透明基质软片做底物；也可以用X光软片，照相或电影胶卷作暴光、显影、定影处理制成片基完整的全黑软片；或直接选择片基完整的全黑软片。规格大小视需要而定。测试前，软片先放入清水浸泡5-60分钟，待其浸润后捞起备用。测试时，由于软片的底膜为明胶涂层，这是一层蛋白质干胶，在它湿润后于一定温度时，可被蛋白酶水解脱落。这一脱落过程会连带它表面经处理成黑色的不溶银或碳黑之类物质涂层脱去而使软片露出透明空斑。

本发明将待鉴定的微生物匀浆或动植物新鲜健康清洁的组织采下压榨出汁，或将组织用利刀切片。测试时，将徽生物匀浆或榨出的组织汁液10微升以上直接从固定点滴到平放的软片涂有明胶层的药膜面上，汁液量以不出片外为准。为了减少挥发，滴后可以用培养皿将软片反扣罩住。在10-40℃室温下反应20分钟至24小时后，用清水冲洗，即可观察软片上酶水解明胶底膜的透明蚀出斑情况。如是直接切片测定，则将动植物器官组织切片的截面紧贴到软片的药膜面上，用夹子紧固后，小心揩去组织与软片交接处可能浸出的液珠，装入塑料袋中，在10-40℃室温下反应1-10小时后从袋中取出，移走测试组织，用清水冲洗软片，观察水解蚀出斑出现的情况。

采用本发明方法测试后，根据软片蚀斑是否出现即可判断该微生物匀浆或动植物组织是否含酶。当所测试的生物不含酶时，软片不出现蚀斑；含酶时，软片上蚀出斑的透明度大小与含酶量有正比例关系。含酶量低的生物，测试后软片出现透明度较低的甚至轻微的点状空斑，酶量高的生物，测试后软片出现全透明蚀斑。

表1是木瓜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，糜蛋白酶的不同活性滴后与软片被蚀空斑透光率关系。表1：