[发明专利]酶联免疫测定增敏剂和一步测定法

说明书

本发明属于酶联免疫检测增敏剂，尤其是使用该增敏剂进行酶联免疫一步法测定。

现有酶联免疫检测多采用“二步法”，该技术是由Engvall    Perlmann和Weemene等人1966年创建的，已沿用20多年，经不断改进和完善后应用到临床医学的许多领域。酶联免疫（Enzgme    Immun    Assag-EIA）技术的实验原理是：特异性的抗原或抗体在一定条件下能结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶连接所形成的结合物仍然能保持其特异性的免疫反应和酶的活性，结合物和相应的抗体或抗原结合后，可根据加入酶底物溶液的颜色反应判定有无相应的免疫反应，且颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量成比例关系，反应过程见图1。这是一种既特异又敏感的疾病诊断方法，具有安全、稳定、易观察等特点，但现有的测定技术操作繁琐，每次测定需3～5个小时，且敏感性不理想，满足不了及时诊断的要求。

本发明的目的在于提供一种酶联免疫测定增敏剂以及使用该增敏剂的酶联免疫一步测定法，以缩短测定时间，提高敏感性和准确性，简化操作过程。

本发明的具体技术方案是：在酶联免疫检测中采用一种增敏剂，该增敏剂由葡聚糖、丙三醇和明胶配制而成，其中所用葡聚糖可为葡聚糖5000，配入量为53～32%，丙三醇和明胶的配入量分别为25～41%和22～28%;酶联免疫一步测定法是在固相载体表面同时加入液相抗原、液相酶标记抗体，特异性抗体和上述增敏剂，增敏剂浓度为0.5～4%，并在35～39℃之间温育10分钟，之后洗涤过剩的酶标记物和痕量抗原，一次性生成固相抗体-抗原-酶标记抗体（Ab-Ag-Ab-E）复合物，然后再加入酶底物显色。其反应机理是：该增敏剂在反应过程中使用液相酶标抗体与液相抗原优先结合生成Ag-Ab-E复合物：

Ag+Ab ()/() Ab+Ag K＝（AgAb）/（Ag）（Ab）

平衡常数变大，随着分子量的增大，在引力的作用下，加速了Ag-Ab-E向固相表面运动，分子间引力F＝Q⁺Q^-/ad²，分子增大，电荷量也增大，这样作用力也增大，加速了固相抗体与液相Ag-Ab-E反应速度，从而使整个反应过程加速，增敏剂在上述反应过程中还具有亲水性增强的特点，因为免疫球蛋白属于疏水性优球蛋白类，纯化后高浓度时为微混溶液，当用本发明提供的增敏剂后，由于IgG分子空间结构和分子肽链发生了变化，易溶于水，且为清亮溶液，溶解度增加，从而有利于反应的进行，同时采用本发明后不发生免疫沉淀反应，使酶标抗体具有单质点的特性，它与特异性抗原的结合是一对一，或是1个抗原分子结合2～10个酶标记抗体，具备抗体过剩免疫反应特点，故使灵敏度明显提高。

本发明与现有技术相比具有下列优点和积极效果：由于在本发明中采用了增敏剂，故加速了酶联免疫反应过程，使两步法需要3～5小时才能完成的测定过程缩短到仅要20分钟就可完成的一步法，敏感性较两步法提高了5～10倍，且加样微量，检测敏、准、快、简，应用该增敏剂可生产出酶联免疫诊断试剂的换代新产品，为临床医学疾病诊断提供了一种更新更准确的手段和方法。

图1为现有技术中固相双抗体“夹心酶联免疫两步法示意图”;

图2为本发明的固相双抗体“夹心酶联免疫一步法示意图”;

图3为抗体过剩反应。

实施例1

取53%的葡聚糖5000，丙三醇25%，使它们溶解在蒸留水中，加温至37℃，加入22%的明胶混合后即成混合溶液。在该溶液中加入赖根过氧化酶标记抗体，即成酶稀释液，待用。

实施例2

取32%的葡聚糖5000，和25%的丙三醇，溶解在蒸馏水中后，加温至37℃，加入28%的明胶混合后即成混合液，以下步骤同实施例1。

实施例3

在固相载体表面同时加入液相抗原，液相酶标记抗体，特异性抗体或抗原以及浓度为0.5%的增敏剂，置37℃温育反应10分钟，洗涤过剩的酶标记物和痕量抗原，得到一次性生成的固相抗体-抗原-酶标记抗体（Ab-Ag-Ab-E）复合物，然后加入酶底物显色，10分钟后取出，用酶标分析仪进行分析计算即可得到测定结果。