[发明专利]牛生长激素释放因子的前体形式及有关的DNA化合物

说明书

生长激素释放因子（GRF）可用来刺激人和动物体内生长激素的产生。牛GRF（bGRF）的兽医学应用特别重要。现已阐明了成熟bGRF的氨基酸顺序（Esch等，BBRC  117：772-779，1983）。然而，在本发明之前，一直没有搞清编码bGRF的天然DNA顺序。本发明提供了前所未知的多肽化合物，包括两种形式的bGRF前体和bGRF肽。本发明还包括编码本发明多肽化合物和成熟bGRF的DNA化合物。

本发明提供的DNA化合物包括编码牛生长激素释放因子、bGRF前体及bGRF先导肽的DNA顺序。本发明提供的多肽化合物中除了与bGRF前体相连的bGRF先导肽之外，还包括bGRF前体。

本发明的多肽化合物为SEQ  ID  No.4或6及其可药用酸加成盐或羧酸加成盐。

本发明的DNA化合物包括编码成熟bGRF、bGRF前体和bGRF先导肽的DNA顺序。编码成熟bGRF的优选DNA顺序为SEQ  ID  No.1。

编码bGRF前体的优选DNA顺序为SEQ  ID  No.3。

编码前面接有先导肽顺序的bGRF前体的优选DNA顺序为SEQ  ID  No.5。

本发明还提供了一些药物组合物，其中的活性成分为包含bGRF前体的多肽化合物。最后，本发明提供诱导生长激素释放的方法，该方法包括给予包含bGRF前体的多肽化合物。这些组合物和方法可用于在包括人、猪、牛、羊、禽类和鱼在内的各种动物体内诱导生长激素的释放。这些组合物和方法优选用于牛。

下列章节对本发明作了更详细的叙述。为清楚和便于理解本发明起见，下列术语和缩写定义如下。

GRF：具有生长激素释放因子活性的多肽。

GRF（1-29）NH₂：GRF中达到全部效力所需的最少部分。

大肠杆菌中的高水平表达：以能用考马斯蓝染色法检测出基因产物的水平生产由克隆基因编码的GRF类似物。

孤立DNA顺序：其位置与其在基因组DNA中的天然位置不同的任何DNA顺序，无论是怎样构建或合成的。此定义包括除天然态以外所有形式的孤立DNA顺序。例如，该DNA顺序可以插入到质粒或噬菌体载体中，或者插入到它原来所在的有机体或任何其他有机体的基因组中，以增加基因剂量。

成熟bGRF：bGRF（1-44）;SEQ  ID  No.2

bGRF前体：bGRF（1-76）;SEQ  ID  No.4

这里提供的附图未按确切比例画出。

图1：质粒pHS  507的限制位点和功能图谱。

本发明提供一些孤立DNA化合物，这些化合物包含编码成熟生长激素释放因子、bGRF前体和与bGRF前体相连的bGRF先导肽的DNA顺序。本发明还提供一些多肽化合物。

虽然以前已阐明了一种形式的成熟bGRF的氨基酸结构（Esch等，Biochem.Biophys.Res.Commun.117：772，1983），但本发明提供的是迄今为止尚属未知的bGRF前体。该前体化合物可由SEQ  ID  No.4及其可药用酸加成盐或羧酸加成盐表示。这种bGRF前体特别有用，因为它满足了本领域对具有bGRF活性且能在大肠杆菌中高水平产生的化合物的需求。这些化合物的大小足以避免在大肠杆菌中成熟GRF表达过程中所遇到的严重降解问题（参见例如Kirschner等，J.Biotech.12：247-248，1989）。

本发明的另一种多肽化合物是在氨基末端连有bGRF先导肽的bGRF前体。该化合物可由SEQ  ID.No.6及其可药用酸加成盐或羧酸加成盐表示。

SEQ  ID  No.6化合物在哺乳动物细胞中产生时特别有用。先导肽引起多肽产物的分泌，随着产物的分泌而切除先导肽。

本发明的所有肽化合物都可由本领域公知的化学方法来制备，包括固相肽合成法或重组法。这两种方法都描述于美国专利4，617，149，该专利在此列为参考。如果希望达到高产率，则优选重组法。构建任何所需DNA顺序的一般方法见Brown等人的报导（Methods  in  Enzymology，68：109，1979），该文献在此列为参考。

这些DNA顺序可以用DNA自动合成仪来合成，例如用ABS（Applied  Biosystems，850  Lincoln  Center  Drive，Foster  City，CA  94404）380B型DNA合成仪。这些DNA顺序也可通过聚合酶链反应来产生。参见例如1987年3月2日公开的美国专利公告0258017。