[发明专利]编码类黄酮途径酶的遗传序列及其应用

说明书

总的来说，本发明涉及编码类黄酮途径代谢酶的遗传序列及其应用。例如用于控制植物和其他有机体的着色作用。

花卉工业的目标就是致力于培育出新的不同的显花植物品种。产生这种新品种的有效方法是通过对花卉颜色的控制，曾使用过传统的培育技术成功地使大部分商业花卉品种显示出各种各样的颜色。但是，这种技术受到某种特定种属基因库的限制，鉴于此原因，对于一个花卉品种很少有全色谱的花色种类。的确，由于兰色花卉来源有限，在荷兰1988年通过拍卖系统出售的切花不到百分之五是兰色花。在十二种销路最好的花卉中，只有鸢尾和小苍兰属提供兰色品种，并且这些品种占整个花卉销售量的不到百分之四。培育主要切花种属例如：玫瑰，菊花，荷兰石竹和非洲菊的兰色品种，将为切花和装饰市场开拓广阔前景。

花的颜色主要取决于两种类型的色素：类黄酮和类胡萝卜素。类黄酮可产生从黄到红到兰范围内的颜色。类胡萝卜素带来橘黄或黄色，并且通常是黄色或橘黄色花卉中的唯一色素。在花卉颜色中起主要作用的类黄酮分子是花色素苷，这种物质是花青素，翠雀素，3′-甲花翠素，芍药色素，锦葵色素和天竺葵色素的糖基化衍生物，并且位于液泡中。不同的花色素苷可以带来明显不同的颜色。花卉的颜色还会受到与无色类黄酮的共同色素沉着。金属络合作用，糖基化，酰化，甲基化及液泡pH的影响（Forkmann，1991）。

已经完善地建立了类黄酮色素的生物合成途径（以后称之为“类黄酮”途径），如图1所示（Ebel和Hahlbrock，1988;Hahl    brock和    Grisebach，1979，Wiering    and    de    Vlaming，1984;Schram    et    al，1984;Stafford，1990）。该途径中第一个指定的步骤包括三分子的丙二酰基辅酶A与一分子的对一香豆酰CoA的缩合反应。该反应受苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）的催化。此反应的产物，2′，4，4′，6′-四羟苯基苯乙烯酮，通常很快被苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶（CHI）异构化而产生柚配质，柚配质接着被黄烷酮3-羟化酶（F3H）在中心环的3位上羟基化而产生二氢莰非醇（DHK）。

二氢莰非醇的B环可以在3′或同时在3′和5′位被羟基化而分别产生二氢五羟黄酮（DHQ）和二氢杨梅黄酮（DHM）。在此途径中的两个关键性酶是类黄酮3′-羟化酶（以后称之为3′-羟化酶）和类黄酮3′，5′-羟化酶（以后称之为3′，5′-羟化酶）。3′-羟化酶作用于DHK产生DHQ，并且作用于柚配质产生圣草酚。3′，5′-羟化酶是一种广谱酶，可以催化柚配质和DHK的3′和5′位的羟基化，以及圣草酚和DHQ的5′位羟基化（Stotz    and    Forkmann，1982），在这两种情况分别产生五羟黄烷酮和DHM。B环的羟基化方式在决定花瓣颜色方面起着重要作用。

在微粒体提取物中类黄酮的3′-羟基化需要NADPH和氧气以及柚配质或DHK的糖苷配基。已对绉叶欧芹细胞培养物酶进行细致的研究（Hagmann et al.，1983）。由于它受一氧化碳，细胞色素C和NADP⁺的抑制，说明这种酶是一种细胞色素P450-依赖性酶。在玉米中也证实了这种相似的酶活性（Larson and Bussard，1986）。3′，5′-羟化酶也是细胞色素P450类的酶。细胞色素P450酶广泛存在于自然界中，并且已在脊椎动物，昆虫，酵母，真菌，细菌和一种植物中进行表征。已经确定了至少154种细胞色素P450基因的序列，这些基因归属于27个不同的基因族（Nebert    et    al，1991）。在一个族内，P450蛋白序列的一致性一般大于40%，而在相同的亚族中序列的一致性大于46%（Nebert    et    al，1991）。有关植物细胞色素P450的资料是有限的。

对植物中与类黄酮途径有关的3′或3′，5′-羟化酶活性或其他酶的控制，提供了一种控制花瓣颜色的方法，从而使单一品种表现出广谱的花色。根据本发明，已经识别和克隆了编码类黄酮途径酶如3′，5′-羟化酶的遗传序列。这些重组序列可以允许对DHK代谢进行调节，以及调节其他底物如DHQ柚配质和圣草酚的代谢，从而确定花色素苷的羟化方式，以提供一种控制花瓣颜色的手段。但是，本发明可以从花卉延伸到水果、蔬菜植物以及例如装饰植物的叶子。

因此，本发明的一方面提供了一种核酸分离物，包括一种编码二氢莰非醇（DHK）羟化酶或其衍生物或其部分分子的编码序列或它的互补序列。