[发明专利]一种用于分析体液的液相色谱固定相的合成方法

说明书

本发明是关于高效液相色谱固定相的合成方法。

用于体液直接进样分析的高效液相色谱固定相对于体液中的蛋白质不保留，而分析物能被其保留，进行色谱分离，这种固定相能广泛用于药物分析和临床分析，具有重要的商业价值。

美国4544485号专利介绍了一种内表面反相填料(ISRP)。其制备方法是，硅胶(5μm，8nm)首先和γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷反应，引入缩水甘油氧基丙基键合相，然后用羰基二咪唑活化，通过氨基甲酸酯键合，将肽Gly-L-Phe或Gly-L-Phe-L-Phe的N端连到缩水甘油氧基丙基上，最后用羧基肽酶A使肽链上的苯丙氨酸残基从硅胶外表面上断裂，这种固定相的不足之处是，由于使用酶反应，产品成本高，且每批产品之间的重现性难以得到保证。

一个正在审理的，属于Feibush和Gisch美国专利中，制备了一种体液直接进样用固定相，称作屏蔽疏水固定相(SHP)。SHP的载体上键合有一个亲水性聚氧化乙烯的网状结构，包裹在其内部的是疏水的苯基。体液中的小分子溶质可以通过网状结构，渗入内部，与疏水基团作用而被保留。大分子，如蛋白质，则被亲水屏蔽网所阻拦，不被保留从柱上洗脱下来。SHP柱的应用研究也报告在J.Chromatogr.，433(1988)264。

Desilets，Rounds和Regnier介绍了半透表面反相柱填料的合成。该填料以10nm硅胶为基体，疏水的键合相之外共价键合聚乙二醇，形成一个亲水高聚物半透层，由于半透层的阻挡，生物试样中的蛋白质不能与疏水相接触，而小分子却能通过半透表面实现色谱分离。

Haginaka和Wakai为提高制备填料的重复性和避免使用酶反应，发展了混合功能团固定相(MFP)。合成MFP包括三个基本步骤：引入γ-缩水甘油氧基丙基，引入疏水基团，环氧键转化为双醇基，MFP硅胶载体的内外表面含有相同的亲水和疏水基团，在新制备的MFP柱上，将人血清试样几次进样后，血清白蛋白的回收率就可达到100％。这表明，外表面的吸附部位被蛋白质封闭后，MFP就可用于直接进样分析。

半透表面反相柱填料和混合功能团固定相都是通过γ-缩水甘油氧基引入亲水基团，由于该基团和疏水基团都是通过硅烷和硅胶上的硅羟基反应被键合，在硅胶上难以同时保持较多的亲水和疏水基团存在。

与本发明有关的已有技术可在下列文献中找到：

[1]T.C.Pinkerton，J.Chromatogr.，544(1991)13.

[2]J.A.Perry，J.Liq.Chromatogr.，13(1990)1047.

[3]D.J.Gisch；B.T.Hunter；B.Feibush，J.Chromatogr.，433(1988)264.

[4]C.P.Desilets；M.A.Rounds；F.E.Regnier，J.Chromatogr.，544(1991)25.

[5]J.Haginaka；J.Wakai，Chromatographia，29(1990)223.

本发明的目的是提出用于体液直接进样分析固定相的新合成方法，该法有如下特点：1.合成路线简单；2.成本最低；3.不同批次的产品之间重现性好；4.由于采用新的合成路线，使键合相同时具有较多可与小分子相互作用的基团和亲水基团，前者对药物等小分子的保留是至关重要的，而后者的存在使体液中的蛋白质不被或较少程度地保留在色谱柱上。

本发明的基本构思是，含三个烷氧基的硅烷与硅胶反应后，在键合相的硅烷分子中，未与硅羟基作用的剩余烷氧基可进一步和聚乙二醇反应，增加键合相的亲水性，引入亲水基团并不是通过和硅胶载体上羟基的作用来实现的，因此，不存在和原有的键合反应竞争硅羟基的问题。这是增加键合相亲水性简单且合理的途径。在所有技术文献中，其研究方法均与本发明构思不同。本发明的构思已通过实验发展成为实用技术。

实现本发明的方法包括两个步骤。第一步是把R基三烷氧基硅烷R-Si-(OR’)₃键合到硅胶上。根据分析物的性质，可选择不同R基的硅烷进行键合反应。R可以是苯基、烷基，或含氨基、氰基、巯基的基团；第二步是利用第一步反应产物和聚乙二醇反应，增加键合相的亲水性。根据分析物的性质，R基可以是极性的，非极性的或具有离子交换性质的基团。因此，可按上述合成途径，制备出一系列的体液直接进样分析用固定相。

聚乙二醇的引入，除增加亲水性外，还使键合相具有一些新的性质，如亲核基团的存在，可抑制硅胶基体上残余的硅羟基效应。