[发明专利]二羟乙酸的生产方法

说明书

本发明是关于一种改进了的生产二羟乙酸的方法，此方法是利用酶催化氧化羟基乙酸，具体地说，涉及采用固定在不溶载体上的羟基氧化酶和过氧化氢醇作为催化剂。

羟基氧化酶一般存在于多叶的绿色植物或哺乳动物细胞中，催化氧化羟基乙酸生成二羟乙酸，且同时产生过氧化氢，陶伯特（N.E.Tolbert）在“J.Biol.Chem.”Vol.181，905-914（1949）中首先报道了一种酶，它由烟草叶中提取而得，它能够通过生成二羟乙酸的中间体催化氧化羟基乙酸形成甲酸和二氧化碳，且加入一些特定的化合物，如乙二胺，就可限制中间产物二羟乙酸的继续氧化，氧化大约是在PH8下进行，典型使用的羟基乙酸浓度为大约3-40mm，最佳的羟基氧化PH值为8.9。且据报道100mm的草酸能抑制羟基氧化酶的催化作用。类似地，里查森（K.E.Richardson）和陶伯特在“J.Biol.Chem.”Vol  236，1280-1284（1961）中报道，三羟甲基氨基甲烷缓冲液可以在羟基氧化酶催化氧化羟基乙酸中抑制草酸的形成;克莱哥特（C.O.Clagett）、陶伯特和伯里，（K.H.Burris）在“J.Biol.Chem.”Vol178，977-887（1949）中报道，羟基氧化酶用氧催化氧化羟基乙酸的最佳PH值范围是7.8～8.6，最佳温度范围是35℃～40℃;

查里克（I.Zelitch）和澳克（S.Ochoa）在“J.Biol.Chem.”Vol  707-718（1953）中以及罗滨逊（J.C.Robinson等在“J.Biol.Chem.”Vol  237，2001-2009（1962）中报道，在菠菜羟基乙酸氧化催化过程中，甲酸和二氧化碳的生成，是由于非酶反应过氧化氢和二羟乙酸反应造成的。他们发现，加入一种能使过氧化氢降解的过氧化氢酶，可以通过抑制甲酸和二氧化碳的生成来大大提高二羟乙酸的产量。加入FMN（黄素单核苷酸）也能大大提高羟基氧化酶的稳定性。

福里格（N.A.Frigerio）和哈伯（H.A.Harbury）在“J.Biol.Chem.”Vol  231，135-157（1958）中已报道了有关羟基乙酸氧化酶的制备和性质，并发现纯化了的酶在溶液中很不稳定，并认为这种不稳定性是由于FMN和酶活性部位连接力太弱以及酶催化活性的四聚物或八聚物降解成酶催化非活性的单聚物或双聚物造成的，而且形成了不可逆的凝聚和沉淀。在酶液中加入FMN可以提高它的活性。且高浓度蛋白或高离子强度可保持酶呈四聚物或八聚物形态。实际上，羟基乙酸催化氧化生成二羟乙酸的文献报道很多，例如：

酶的分离（通常包括一种分析方法）

I.Zelitch  in  Methods  of  Enzymology.Vol.1，Academic  Press，New  York，1955，p.528-532，从菠菜烟草叶中

M.Nishimura  et  al.，Arch.Biochem.Biophys.，Vol.222，397-402（1983），从南瓜、猪耳中

H.Asker  and  D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108（1983），从鼠肝中

M.J.Emes  and  K.H.Erismann，Int.J.Biochem.，Vol.16，1373-1378（1984），从柠檬中

酶结构

E.Cederlund  et  al.，Eur.J.Biochem.，Vol.173，523-530（1988）.

Y.Lindquist  and  C.Branden，J.Diol.Chem.Vol.264，3624-3628，（1989）：

本发明涉及一种二羟乙酸（OCHCOOH）的生产方法，此方法是羟基乙酸（HOCH₂COOH）（200-约2500mM）在羟基氧化酶（（S）-2-羟基酸氧化酶，ECl.1.3.15）和过氧化氢酶（EC1.11.1.6）固定在不溶载体上的情况下，在水溶液中（PH7-10）和氧反应，最佳条件下，可以获得高产率的二羟乙酸，同时羟基乙酸转化率很高。且固定化的酶能再生和重新利用。