[发明专利]胶原样多肽

说明书

本发明涉及新的胶原样多肽。更具体地说，本发明涉及掺入了体现化学或生物学活性的功能片段和用以增强加工性能的结构成分的胶原样聚合物。

胶原是高等动物体内最重要的结构蛋白，在大多数脊椎动物中占蛋白质总量的约三分之一。胶原在人体中的普遍存在使得人们有兴趣将胶原样构建体在生物医学领域中加以广泛应用，特别是作为植入物替代或补充受损或患病的结构组织。

胶原可以从脊椎动物的皮肤、腱和骨胳中分离，也存在于无脊椎动物的全身。天然衍生的胶原物质依其来源而有多种多样的化学结构。这些物质可以在进行改变后得到新的物质，如皮革和明胶。

胶原具有多个水平上的结构等级。单个肽链的长度为1000-1100个氨基酸，并有由重复的三肽Gly-X-Y组成的氨基酸顺序，其中的X和Y可以是任何氨基酸，但最可能的是脯氨酸或羟脯氨酸。20个基本氨基酸和羟脯氨酸及其对应的单字母和三字母代码列于表12中。脯氨酸是在蛋白质合成过程中掺入到肽链中的，羟脯氨酸不是在蛋白质合成过程中掺入的，而是由合成后修饰作用由脯氨酸衍生而来。天然胶原或作为本发明主题的任何胶原样聚合物中的任何脯氨酸残基，原则上都可以经适当的化学或酶处理而转变成羟脯氨酸。因此，在聚合物结构或任何终产物的物质组合物中提到的脯氨酸，都应引伸地理解为是指脯氨酸或羟脯氨酸。但是，因为羟脯氨酸不能在蛋白质合成过程中掺入，并且也不存在编码羟脯氨酸的DNA顺序，所以，如果在任何结构中提到最初在体内合成的脯氨酸或编码脯氨酸的DNA顺序，都应理解为仅指脯氨酸。

经常出现的脯氨酸（和羟脯氨酸）残基，指导肽链形成每个三肽一圈的（左手）螺旋构象。每隔两个位置出现的甘氨酸（没有大侧链），使三条螺旋链裹在一起形成一个超螺旋的右手三股螺旋，正是这个每圈有30-40个残基的三股螺旋被认为是胶原的特征，限定了胶原的结构特点。三条肽链间形成的化学交联稳定了螺旋结构。

杆状三股螺旋结构称为原胶原分子。原胶原分子头尾相连以平行束排列成行形成胶原细纤维。原胶原分子间的头尾间隙沿每一细纤维长度方向有规律地交错开，产生特征性条纹图型。胶原细纤维可以组成交联的平行束而形成纤维，如腱中的纤维;也可以以随机交织的交联网络形式存在，如皮肤中的胶原。

在细菌中克隆特异DNA顺序的可能性已挖掘出了通过细菌生产新蛋白质的潜力。这些技术使科学家能设计出比天然来源蛋白质具有更广泛特性的构建体。

Ferrari等人在已公布的PCT申请（WO    88/03533）中公开了生产含有重复顺序的高分子量肽的方法。用合成的能够表达许多单个重复肽单位的核酸寡聚物组建核酸顺序，并将寡聚物连接成所需长度的多核苷酸。编码寡聚肽顺序的单个单位利用了氨基酸密码子的冗余性以避免以前由含有多重复单位的基因带来的问题。单个肽单位具有4-30个氨基酸，通常在同一个单位中相同的氨基酸至少出现两次，并通常被至少一个氨基酸分隔开。

Cappello和Ferrari在已公布的PCT申请（WO    90/05177）中公开了用重组技术制备的多肽聚合物。这些聚合物以天然存在的蛋白质（例如丝和胶原）为基础，并由于引入了一个插入的氨基酸顺序而被修饰。插入的氨基酸顺序能够与周围分子相互作用，但通常不参与聚合物的排列成分。插入顺序可以是一段天然存在的顺序，也可以是一段被修饰过的天然存在顺序，它可以提供进行交联或结合抗体或其它分子的化学活性位点。该专利申请还讨论了能在高温下经受热可逆性凝胶化作用的胶原样聚合物（CLP）。CLP聚合物主要由重复三肽顺序GPP组成，还包括其它三肽以减少总的基因重复性。还讨论了作为软涂料使用的CLP聚合物，该聚合物由于导入了Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Pro顺序而具有细胞附着官能团。

Williams等人的已公布的PCT申请（WO    88/05082）公开了包括胶原类似物在内的肽寡聚物的微生物生产方法。

因为天然胶原具有交联结构，如不经过化学或酶学消化作用继而丧失分子量，就不能重新溶解而用于纺丝、成型等方面。消化作用还使之不可能恢复在天然胶原中存在的全等级结构，因为在消化作用中被破坏的肽片段中有一些是指导高级结构的形成所需的。最后，天然胶原不容易被修饰而引入特定的化学或生物学官能团。